由于co-IP相對問(wèn)題較多，以co-IP為例進(jìn)行介紹。

 Step 1固定抗體

Step 2加樣

Step 3結合，去除非特異性蛋白

Step 4靶蛋白（紅色）洗脫或者互作蛋白復合物（紅色+黃色）洗脫

Step 5分析檢測—Western Blot或者質(zhì)譜

常用“黑話(huà)”

 上圖證明了EDR1和EDR4有相互作用。如果想要設計好實(shí)驗，讓我們先弄清以下“黑話(huà)”的意思吧。

陽(yáng)性對照：證實(shí)細胞裂解物中確實(shí)存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白對（co-IP，比如誘餌蛋白X和靶蛋白Y），即為常說(shuō)的input?？芍苯尤〕楹玫牡鞍兹芤哼M(jìn)行Western。

陰性對照：用來(lái)排除假陽(yáng)性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白對都檢測到了，固然是值得高興的，但是這結果是不是假陽(yáng)性呢？還得做個(gè)陰性對照。陰性對照如何設置呢？考慮到整個(gè)實(shí)驗體系會(huì )出現beads、抗X抗體、誘餌蛋白X、靶蛋白Y（co-IP）：

 *注意：總蛋白上樣量過(guò)多也會(huì )造成 非特異性結合，建議上樣量為500ug-1mg。上樣之前一定要先用BCA定個(gè)量！定個(gè)量！定個(gè)量！

pre-clear：上樣前先用裂解液過(guò)一遍柱子，減少基質(zhì)本身對蛋白的吸附。

Output：在某些co-IP實(shí)驗中，實(shí)驗人員會(huì )把IP后的上清分別進(jìn)行誘餌蛋白X和靶蛋白Y的WB檢測，該對照組稱(chēng)為output組。

內源性co-IP實(shí)驗，如果終結果為陽(yáng)性，則可以證明兩個(gè)蛋白之間存在相互作用；但是結果為陰性，是否兩個(gè)蛋白就一定不發(fā)生相互作用了了呢？也不一定。有可能是兩個(gè)蛋白是弱相互作用力，這時(shí)候可能需要交聯(lián)劑協(xié)助，鎖定強化弱互作蛋白；也有可能是內源蛋白表達量低，可先做過(guò)表達co-IP作為對照。

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