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如何高效又穩定的構建干細胞疾病模型?

更新時(shí)間:2020-12-14瀏覽:1246次

為什么多能干細胞大有前途?

      人類(lèi)多能干細胞具有自我更新能力并且具有分化成為任何細胞類(lèi)型的潛力,幫助克服現有動(dòng)物模型中對某些疾病的限制。雖然動(dòng)物模型長(cháng)久以來(lái)被用于研究疾病的不同發(fā)育階段,但該類(lèi)模型并不完美,比如,動(dòng)物模型心臟的尺寸以及靜息心率與人類(lèi)有很大的差異,在一些情況下某些疾病的表型可能是無(wú)法準確呈現。

 

        此外,病人來(lái)源的人類(lèi)細胞的培養雖也逐漸被用于科學(xué)研究以及醫療發(fā)展。但是從病人血液或者組織中分離得到的這些細胞系很難持續的培養,同時(shí)特定的細胞系也很難從中分離得到。

 

        人類(lèi)多能干細胞(Pluripotent stem cells,PSCs)恰恰改變了以上困境。PSCs來(lái)源于正常的原代細胞,具有無(wú)限自我更新的能力,可通過(guò)誘導獲得特定的細胞類(lèi)型。誘導多能干細胞(iPSCs)越來(lái)越多地被用于人類(lèi)疾病模型的研究,為疾病模型的建立及其在藥物篩選中的應用創(chuàng )造了新的可能性。此外,結合CRIPSR-Cas9等基因編輯技術(shù),還能夠在iPSCs疾病模型中引入或糾正疾病相關(guān)的突變,從而研究突變對疾病表型的影響。

 

     基于iPSC構建疾病模型的流程基于iPSC構建疾病模型的步驟包括體細胞重編程為hiPSC、通過(guò)基因組編輯產(chǎn)生基因對(包括對照和突變的hiPSCs)、hiPSCs細胞系的克隆和鑒定、hiPSCs細胞系的分化以及疾病模型的可視化。

 

        基于iPSC構建相關(guān)疾病模型及研究進(jìn)展帕金森癥是一種在中老年中常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,主要生理學(xué)癥狀是多巴胺能神經(jīng)元的丟失、α-突觸核蛋白的聚集、路易氏體的出現?,F有的帕金森癥治療僅針對疾病的癥狀,不能治愈或延緩病情發(fā)展。為尋找到更有效、確的靶點(diǎn),一個(gè)全面且準確的帕金森癥模型變得異常重要。一般而言,遺傳小鼠模型不能代表患者中觀(guān)察到的病理生理神經(jīng)退行性變和蛋白聚集模式。另一方面,局部或系統給予神經(jīng)毒素的帕金森癥動(dòng)物模型雖成功地復制了多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退行性變化,但它們不能以緩慢、漸進(jìn)的方式再現退行性病變,也不能形成在病人病理中出現的路易氏體。

 

       利用細胞重編程和基因編輯技術(shù),可從患者體細胞中產(chǎn)生疾病特異性的iPSC,有助于了解功能相關(guān)性的分子發(fā)現和個(gè)人遺傳變異等。2020年The New England journal of Medicine雜志上發(fā)表文章題為《Personalized iPSC-Derived Dopamine Progenitor Cells for Parkinson's Disease》,報道了從自體誘導多能干細胞分化的中腦多巴胺能祖細胞植入特發(fā)性帕金森病患者體內產(chǎn)生的緩解帕金森癥的研究。

 

         患者特異性祖細胞是在良好的制造條件下產(chǎn)生的,并具有黑質(zhì)致密部神經(jīng)元的表型特性;在人源化小鼠模型的實(shí)驗中表明,這些特異性的祖細胞缺乏免疫原性,當被植入帕金森癥病患者的殼核,不需要進(jìn)行免疫抑制。帕金森癥的臨床癥狀在誘導的特異性祖細胞植入后18到24個(gè)月穩定或改善。因此,利用iPSC在臨床方面緩解帕金森癥已經(jīng)初見(jiàn)曙光。

 

    誘導多能干細胞的技術(shù)除了用于建立帕金森癥的模型之外,還在多種疾病的模型建立以及科學(xué)研究過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。比如誘導多能干細胞來(lái)源的心肌細胞模型可用于研究心肌細胞的功能和功能障礙、藥物篩選和毒性、以及心臟病新藥的開(kāi)發(fā)。

 

除此之外,誘導多能干細胞還廣泛用于建立表征不同3D結構的組織和類(lèi)器官(Organoid)。比如2013年Nature發(fā)表論文題為《Cerebral organoids model human brain development and microcephaly》,開(kāi)發(fā)出了人類(lèi)誘導多能干細胞的衍生的3D器官培養系統,利用該類(lèi)器官模型,研究人員使用RNA干擾和患者特異性誘導的多能干細胞來(lái)模擬小頭癥(Microcephaly)患者,是一種很難在小鼠身上進(jìn)行重現的疾病,并證明了患者器官樣體中神經(jīng)元的過(guò)早分化缺陷可以幫助解釋疾病的表型??偟膩?lái)說(shuō),誘導多能干細胞在復雜的人體組織中衍生的三維類(lèi)器官也能再現發(fā)育過(guò)程和疾病特征。

     但誘導多能干細胞建立相關(guān)疾病模型也并非完美方案。如何將患者來(lái)源的細胞準確分化為目標細胞、如何建立背景類(lèi)似的對照組、防止本身遺傳背景對于一些關(guān)鍵表型的掩蓋作用,以及重編程的效率和表觀(guān)遺傳的特征,都是研究者未來(lái)需要考慮的。沒(méi)有一項技術(shù)是完美的,但誘導多能干細胞模型的建立大大擴展了我們精細模擬疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程以及對藥物篩選和鑒定使用范圍,為未來(lái)開(kāi)發(fā)相應疾病的治療方案和臨床藥物提供了重要工具。

細胞重編程:

     該系統基于復制缺陷型仙臺病毒(SeV)的載體,安全且高效地導入并表達一些關(guān)鍵的遺傳基因,它們是將體細胞重編程為iPSC所必需的。多種細胞經(jīng)驗證,如成纖維細胞、PBMCs、CD34+細胞、T細胞、微血管內皮細胞、尿細胞、羊水細胞、骨骼肌成肌細胞等。此外,CTS™ CytoTune-iPS 2.1 仙臺病毒重編程試劑盒—無(wú)縫轉移至臨床培養。

細胞改造: 

       使用Neon轉染系統進(jìn)行電穿孔或使用Invitrogen Lipofectamine 干細胞轉染試劑進(jìn)行脂質(zhì)轉染,將編輯工具遞送到iPSC中。雖然這兩種方法都能成功完成基因組編輯,但電穿孔遞送基因編輯工具通常編輯效率更高。

 細胞培養:

 單細胞分選hiPSC需要穩定的培養基,既可培養單個(gè)hiPSC且適用于hiPSC擴增培養,同時(shí)無(wú)需每天換液。

 細胞鑒定:

       畸胎瘤形成是證明hiPSC細胞系多能性的方法之一,但這一過(guò)程過(guò)于漫長(cháng)且需要動(dòng)物實(shí)驗。在基因表達分析中使用從hiPSC和擬胚體(一種從hiPSC產(chǎn)生所有三個(gè)胚層的無(wú)偏差方法)分離的mRNA,可通過(guò)檢測hiPSC中是否存在多能性基因及擬胚體中是否存在胚層基因,驗證多能性。除此之外,您也選擇使用PluriTest檢測和KaryoStat檢測。

 

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