1從培養的CCLE細胞系中提取代謝產(chǎn)物

體外培養20種主要癌癥類(lèi)型的928個(gè)癌細胞系，用于124種極性代謝物和101種脂類(lèi)的代謝組學(xué)分析(圖1a)。使用層次聚類(lèi)來(lái)評估細胞系之間的代謝相似性。兩個(gè)主要的聚類(lèi)與造血系和非造血系有很強的相關(guān)性，表明這兩組的主要代謝是有差異的(p<1×10−10,Fisher’s確切檢驗)。為了進(jìn)一步量化代謝物水平(y)與主要癌癥譜系(X)的關(guān)系程度，采用線(xiàn)性回歸模型進(jìn)行分析。結果表明，225個(gè)代謝物中有148個(gè)的譜系效應(定義為r²)大于0.1，表明這些代謝物中至少有10%的跨細胞系代謝物水平差異與譜系相關(guān)。同時(shí)評估了主要癌癥譜系中每種代謝物的平均豐度表明不同腫瘤細胞系代謝譜圖存在差異。例如，磷酸肌酸在食道細胞系中積累，而在腎臟或造血系中不積累，相比之下，1-甲基煙酰胺在大多數腎臟和胸膜細胞系中含量豐富，但在許多其他譜系中含量較低。

2代謝物與遺傳特征的關(guān)系

除了譜系外，癌癥中的遺傳或表觀(guān)遺傳事件也可能改變細胞代謝。為了識別可能由遺傳差異引起的代謝變異，我們構建了一個(gè)包含705個(gè)基因突變和61個(gè)擴增/缺失的遺傳特征矩陣。應用線(xiàn)性回歸模型尋找這些遺傳特征和代謝物水平之間的聯(lián)系(圖1c)。遺傳特征通過(guò)與每個(gè)代謝物的相關(guān)性進(jìn)行評分，并按統計學(xué)意義的順序進(jìn)行比較。有趣的是，我們發(fā)現機械相關(guān)特征往往與異常代謝物水平具有很強的相關(guān)性。下面將討論所選的示例。

首先，無(wú)偏比較結果顯示，對于2-羥基戊二酸鹽(2HG)來(lái)講，IDH1熱點(diǎn)錯義突變是首要的預測遺傳特征(圖1d)。具有這種代謝物異常積累的細胞系大多是IDH1/IDH2突變體(圖1e)，與已有報導相符。值得注意的是,雖然CCLE中并沒(méi)有已知的腎細胞癌(RCC)株系有IDH1 / IDH2突變,其他株系效應分析表明，RCC株系中平均2HG含量比其他株系中多三倍，這與已有研究結果相吻合。

總而言之，通過(guò)代謝物和各種遺傳特征之間的無(wú)偏關(guān)聯(lián)分析，證實(shí)了先前發(fā)現的將致癌因子變化(如IDH1/KEAP1/ME2)與異常代謝物相關(guān)。

3 DNA甲基化調節代謝物豐度

接下來(lái)，我們檢測DNA甲基化并評估其與代謝物水平的關(guān)系。2114個(gè)基因的mRNA轉錄本與其啟動(dòng)子CpG甲基化水平顯著(zhù)相關(guān)。相關(guān)系統分析揭示與潛在的代謝失調相關(guān)的數量驚人的特異性改變(圖2a)。這些觀(guān)察結果可分為兩類(lèi)：

1、DNA高甲基化似乎通過(guò)抑制某些代謝物降解途徑來(lái)影響代謝物水平，例如，SLC25A20的甲基化與長(cháng)鏈類(lèi)?；鈮A(如油基肉堿)的積累具有很強的相關(guān)性(圖2b)。SLC25A20，也被稱(chēng)為肉堿/?；鈮A轉位酶，使?；鈮A通過(guò)線(xiàn)粒體內膜進(jìn)行脂肪酸氧化。SLC25A20高甲基化與標記的mRNA轉錄減少相關(guān)(圖2c), 伴隨著(zhù)14、16或18個(gè)碳的?；湹孽；鈮A類(lèi)物質(zhì)顯著(zhù)升高 (圖2 d-g), 但與其他具有較短或較長(cháng)的?；湹孽；鈮A沒(méi)有關(guān)系，這表明在這些細胞系中存在一種不尋常的脂肪酸分解代謝缺陷。

2、DNA高甲基化似乎通過(guò)限制生物合成途徑的成分來(lái)調節代謝水平。例如，脯氨酸水平的降低與PYCR1的高甲基化有關(guān)，PYCR1是一種將吡咯啉-5-羧酸鹽轉化為脯氨酸的酶(圖2h，i)。此外，丙氨酸水平的降低與GPT2的高甲基化有關(guān)，GPT2可以通過(guò)轉胺作用合成丙氨酸

4 代謝物依賴(lài)關(guān)系分析 

長(cháng)期以來(lái)，人們一直希望利用失調的癌癥代謝狀態(tài)進(jìn)行治療。為此，我們試圖將代謝變化與DepMap CRISPR-Cas9敲除數據集揭示的癌癥缺陷聯(lián)系起來(lái)，在該數據集中，483個(gè)CCLE細胞系已經(jīng)通過(guò)針對~17,000個(gè)基因的~74k sgRNAs文庫進(jìn)行了篩選。利用CERES評分來(lái)總結基因水平依賴(lài)性(較小的值表示對基因敲除更敏感)，然后就代謝物的變化詢(xún)問(wèn)每個(gè)基因水平依賴(lài)性。這一無(wú)偏的代謝依賴(lài)相關(guān)分析表明，在癌細胞株中觀(guān)察到的不同代謝表型與不同的基因依賴(lài)相關(guān)，因此具有潛在的治療靶點(diǎn)(圖3a)。首先，氧化還原代謝物(包括GSH、GSSG和NADP+)的異常積累(部分歸因于KEAP1突變，見(jiàn)上述分析)與NFE2L2 (NRF2)敲除敏感性增加有關(guān)，NFE2L2是一種參與抗氧化反應的轉錄激活因子(圖3b-d)。值得注意的是，依賴(lài)關(guān)系zui強的是 SLC33A1(圖3b-d)，這是一種乙酰輔酶a轉運體，其在氧化還原穩態(tài)中的作用目前尚不清楚。同時(shí)發(fā)現較低天冬酰胺水平的細胞更依賴(lài)于其合成酶(ASNS)和EIF2AK4 (GCN2，參與氨基酸饑餓反應)(圖3e)。此外，我們還觀(guān)察到一個(gè)有趣的關(guān)聯(lián)，涉及兩個(gè)不同的甘油三酯(TAG)簇(圖3a)。其中一個(gè)簇包含多不飽和標簽種類(lèi)（多于4個(gè)C=C），另一個(gè)簇包含較少不飽和標簽種類(lèi)及單不飽和脂肪酸?；?MUFA)(圖3a)。為了區分富含這兩類(lèi)物質(zhì)的癌細胞系，我們將其標記為高多不飽和脂肪?；?nbsp;(PUFA^high, n=315)或低多不飽和脂肪?；?/span>(PUFA^low, n=325)，排除了那些沒(méi)有明顯脂質(zhì)不飽和差異的細胞系(圖3f)。其他脂類(lèi)如磷脂酰膽堿(PC，圖3g)和膽固醇酯(CE，圖3h)也存在這種不飽和差異。為了驗證這種*的脂質(zhì)利用模式是否與靶標依賴(lài)相關(guān)，對比CERES評分，發(fā)現PUFA^high細胞系對GPX4敲除敏感(圖3i)，GPX4敲除介導了過(guò)氧化PUFA的解毒作用。相比之下，PUFA^low細胞系對合成MUFA的CTNNB1或SCD的缺失很敏感(圖3i)?？傊?，這些無(wú)偏關(guān)聯(lián)分析表明，體外培養的癌細胞具有顯著(zhù)的脂類(lèi)差異，可以根據PUFA分類(lèi)選擇性靶向分析。

5 CCLE細胞系的表型分析

如上所述，較低的天冬酰胺水平與較高的天冬酰胺合成酶(ASNS)缺失敏感性密切相關(guān)(圖3e)。當培養基中天門(mén)冬酰胺缺失時(shí)，ASNS基因的下調明顯阻礙了細胞的增殖?？紤]到一些具有ASNS啟動(dòng)子高甲基化的CCLE細胞系，即使存在其轉錄激活因子ATF4，其ASNS表達也異常低(Fig.4a), 因此推測內在甲基化依賴(lài)型基因抑制可能通過(guò)特定的營(yíng)養剝奪來(lái)選擇性靶向目標基因。為了探索這個(gè)問(wèn)題，使用有24個(gè)核苷酸barcodes標記的544種的CCLE細胞株(圖4b)在氨基酸組成明確的條件種培養，并在處理6天后使用barcode高通量測序方法評估細胞活力。我們發(fā)現，當在限制天冬酰胺條件下生長(cháng)時(shí)，那些異常低表達的ASNS被選擇性地耗盡(圖4 c)。類(lèi)似的，發(fā)現低表達ASS1和GLUL(啟動(dòng)子區域甲基化影響)標記的細胞表達較低，它們對精氨酸供應減少更敏感，對谷氨酰胺也更敏感 (圖4d, e)。綜上所述，這些例子表明，DNA高甲基化影響了對營(yíng)養有效性的依賴(lài)，例如癌細胞亞群中的天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺營(yíng)養缺乏。

6 擴展天冬酰胺酶的治療作用

前面的表型現象促使我們探索天冬酰胺酶的潛在治療價(jià)值超出急性淋巴細胞白血病(ALL)的范圍。我們證實(shí)ASNS高甲基化的細胞也缺乏蛋白表達(圖5a-c)，并且在體外對天冬酰胺酶非具有高度敏感性 (圖5d)。為了確定該依賴(lài)性是否也存在于體內，將7*10⁶的2313287 (ASNS^high)或SNU719 (ASNS^low)細胞分別植入裸鼠的兩側。當腫瘤體積達到100-200 mm³左右時(shí)，用天冬酰胺酶腹腔注射(3000單位/kg/注射，每周5次)或空白對照的方法對小鼠進(jìn)行治療，并在3周內監測腫瘤的生長(cháng)情況。發(fā)現SNU719腫瘤的生長(cháng)明顯下降，而2313287腫瘤的生長(cháng)幾乎沒(méi)有下降(圖5e)。還發(fā)現，在植入和治療這些異種移植腫瘤的過(guò)程中，ASNS的高甲基化和表達丟失得以維持(圖5f)。這些數據也表明ASNS免疫組化可能被應用于天冬酰胺酶試驗的患者分類(lèi)和選擇。同時(shí)檢測癌癥基因組圖譜(TCGA)中胃癌和肝癌的DNA甲基化，發(fā)現它與腫瘤樣本中ASNS表達的降低顯著(zhù)相關(guān)(圖5g)?？傊?，這些結果表明，天冬酰胺酶可以抑制腫瘤細胞系的特定亞群的生長(cháng)，同時(shí)在體內和體外都可以抑制ASNS的表達。

7 CCLE中犬尿氨酸代謝譜圖

除了分析具有營(yíng)養價(jià)值的代謝物外，我們還探索了包括犬尿氨酸在內的信號代謝物的模式。犬尿氨酸由色氨酸分解代謝產(chǎn)生，通過(guò)芳基烴類(lèi)受體(AHR)發(fā)揮免疫抑制作用，抑制效應T細胞增殖，促進(jìn)調節性T細胞生成。這些發(fā)現導致了針對犬尿氨酸通路的IDO1抑制劑聯(lián)合PD1阻斷劑的臨床試驗。在CCLE中，我們觀(guān)察到跨越多個(gè)癌癥類(lèi)型的三個(gè)數量級的細胞內犬尿氨酸濃度 (圖6a)。我們發(fā)現，在發(fā)現和驗證的細胞系中，細胞內較高的犬尿氨酸水平與培養基中分泌更多的犬尿氨酸密切相關(guān) (圖6b)。這些數據表明，具有較高細胞內犬尿氨酸濃度的細胞系也在積極地將其分泌到細胞外空間。通過(guò)將mRNA轉錄本(n=18,205)與犬尿氨酸水平相關(guān)聯(lián)，我們發(fā)現IDO1、IDO2和TDO是與犬尿氨酸水平顯著(zhù)相關(guān)的zui熱門(mén)的三個(gè)位點(diǎn)(圖6c)。有趣的是，我們在IDO1/2或TDO mRNA水平高的細胞系中觀(guān)察到豐富的細胞內犬尿氨酸(圖6d)。根據癌細胞IDO (IDO1為主要形式)和TDO的表達，我們將全尿酸含量高的癌細胞兩類(lèi)，約有三分之一的癌細胞同時(shí)表達IDO1和TDO，其余的由IDO1或TDO驅動(dòng)(圖6e)。在TCGA的不同腫瘤樣本中也可以觀(guān)察到這種差異表達模式(圖6f)。這表明，癌細胞可能使用酶或潛在的兩者都產(chǎn)生犬尿氨酸。接下來(lái)，我們研究了IDO1選擇性抑制劑epacadostat是否在這些不同的環(huán)境中有效阻斷犬尿氨酸的分泌。為了在體外驗證這一點(diǎn)，我們在三個(gè)有代表性的細胞系中研究了epacadostat對犬尿氨酸分泌的抑制作用。我們發(fā)現epacadostat*抑制NCIH596 (IDO1^high)的犬尿氨酸分泌，導致IGR39 (IDO1^high + TDO^high)的犬尿氨酸分泌大量減少，而對JHH7 (TDO^high)的影響很小(圖6g)。因此，這些將高犬尿氨酸與IDO1或TDO mRNA表達聯(lián)系起來(lái)的數據表明，選擇性的IDO1抑制可能只在這些腫瘤的一個(gè)亞群中起作用，并且可能進(jìn)一步受到TDO介導的逃逸。zui近，關(guān)于epacadostat與抗PD-1抗體pembrolizumab聯(lián)合應用于未被選擇的轉移性黑素瘤患者的III期陰性數據被報道，我們的數據提出了這樣一種可能性，即選擇腫瘤中犬尿氨酸含量增加的患者，同時(shí)了解哪些酶正在產(chǎn)生犬尿氨酸，這可能對進(jìn)一步開(kāi)發(fā)IDO/TDO抑制劑至關(guān)重要。