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不明覺(jué)厲!?;?生物素交換法是個(gè)什么 鬼?

更新時(shí)間:2020-04-06瀏覽:3275次

大家在讀醫學(xué)研究文獻時(shí)常常會(huì )看到1種不明覺(jué)厲的研究技術(shù),叫“Acyl-biotinyl Exchange”,

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翻譯過(guò)來(lái)就是?;?/span>-生物素交換法。這種方法主要用于研究蛋白質(zhì)所發(fā)生的翻譯后修飾。

大多數蛋白分子都有多個(gè)不同的翻譯后修飾機制,用以調節蛋白功能。蛋白質(zhì)zui常見(jiàn)的翻譯

后修飾方式叫磷酸化,主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸等殘基位點(diǎn)上,常常通過(guò)特異性的抗體進(jìn)

行檢測。

除了磷酸化之外,蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的方式還有很多,例如糖基化、乙?;?、甲基化、亞

硝基化、谷胱甘肽化、棕櫚?;鹊?。探索蛋白質(zhì)翻譯后修飾的生物學(xué)意義是是生命科學(xué)的

研究熱點(diǎn)之1。

對于醫學(xué)研究而言,如果你在課題研究過(guò)程中發(fā)現某種新報道的蛋白質(zhì)翻譯后修飾剛好參與

調控疾病過(guò)程中該蛋白的功能變化,那么恭喜你,1篇不錯的好文章已經(jīng)在不遠處招手啦。

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?;?/span>-生物素交換法是1種常見(jiàn)的檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方法。蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上

的巰基基團,由于其高反應性,很容易發(fā)生各種氧化還原反應或?;磻?。?;?/span>-生物素交

換法的實(shí)質(zhì)是將所要檢測的翻譯后修飾轉化為?;纳锼鼗鶊F。

整個(gè)交換過(guò)程要分三步完成:

第1步,先封閉可能干擾檢測的噪音,就是其他可被生物素?;陌被釟埢鶊F;

第二步,通過(guò)某種方式將所檢測的翻譯后修飾特異性的轉變成可進(jìn)行?;磻臓顟B(tài),如

還原態(tài)的巰基狀態(tài)或游離的胺基狀態(tài);

第三步,將生物素通過(guò)?;磻?,結合那些轉變生成的可發(fā)生翻譯后修飾的氨基酸殘基。

這樣,原來(lái)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾會(huì )交換成?;纳锼?。再通過(guò)可以選擇性結合生物素的

親和素制備層析柱,就可以富集這些生物素化的蛋白,再通過(guò)抗體11檢測。

2

亞硝基化修飾是1種發(fā)生在半胱氨酸殘基巰基上的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,對很多心腦血管疾病

相關(guān)的蛋白功能有重要的調節效應。以亞硝基化為例,可以幫助我們了解如何通過(guò)?;?/span>-生物素交換法來(lái)研究蛋白質(zhì)的翻譯后修

飾。下面讓我們1起看看如何在實(shí)驗室里通過(guò)?;?/span>-生物素交換法檢測某個(gè)蛋白亞硝基化水

平吧。

首先,工欲善其事必先利其器。不要嫌麻煩,認認真真的配制幾種溶液吧。

第1種,叫 HEN buffer11.9150gHepes 羥乙基哌qin乙磺酸. NaOH,0.0584g 乙二胺四乙酸,

0.004166g 新亞銅樹(shù)堿,加入到 200 ml 超純水中),這可是整個(gè)?;锼亟粨Q反應發(fā)生的

基礎緩沖液哦。

第二種,叫 HENS buffer,就是在 HEN buffer 的基礎上,加入1定比例的 SDS(1般是把 HEN

buffer 25%SDS 9:1 配好)。

第三種,叫裂解液,是在第1種 HEN buffer 的基礎上,每毫升體積里加入 1% NP40 10 μl,

protease inhibitor cocktail 10μl,1 mM PMSF 10μl。裂解液是zui先用到的液體,用于破碎

細胞或組織。

第四種,叫洗脫液,在第二種 HENS buffer 的基礎上,加入 DTT 配制而成(1般 DTT 的終濃

度為 100-200mM)。

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然后,我們就可以按照上面介紹的三大步,對蛋白質(zhì)上亞硝基化修飾的巰基來(lái)進(jìn)行 Acyl

biotinyl Exchange Reaction 了。

第1步,封閉可能產(chǎn)生干擾的噪音:將細胞或組織樣本按 10μl/mg 500μl/孔(六孔板)

加入裂解液,在冰上進(jìn)行超聲裂解處理 5 分鐘, 立即 412000g,離心 15 分鐘。取上清,

加入 4 倍體積的 blocking buffer。

所謂的 blocking buffer,就是在每 ml HENS buffer 中加入 10ul MMTS 儲液(MMTS 的全稱(chēng)是

methyl methanethiosulfonate,是1種特異性的巰基封閉劑,用二甲基甲酰胺配制到 2M 的儲

液濃度)。封閉反應在 50的恒溫水箱中進(jìn)行,1般要 20 分鐘到半小時(shí)。

第二步,將亞硝基化修飾的巰基轉化為可進(jìn)行?;磻挠坞x巰基:把裂解液轉入

離心管里。在離心管中1次性加滿(mǎn)-20 攝氏度的丙酮,-20下靜置 40 分鐘,立即 4,5000g

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離心 20 分鐘,去除上清。

重復步驟三次后得到比較純凈的蛋白質(zhì)。去除丙酮上清后,向沉淀加入用 HENS buffer 所配

制的維生素 C (20 mM,1ml),溶解蛋白并將亞硝基化信號轉變?yōu)榭甚;膸€基分子。

第三步,將生物素通過(guò)?;磻Y合這些轉變生成巰基。加入用 HENS buffer 所配制

的生物素 biotin–HPDP1mM, 1ml),室溫下孵育 2 小時(shí)(用搖床,1定注意避光)。反應完

成后再用丙酮沉淀的方法,去除反應液里小分子,制備純化蛋白。

把反應液轉移入離心管里。在離心管中1次性加滿(mǎn)-20 攝氏度的丙酮,-20靜置 40 分鐘,

立即 4,5000g 離心 20 分鐘,去除上清。重復步驟三次。用 2~3ml HENS buffer *溶

解沉淀物。

zui后,我們還有1個(gè)很關(guān)鍵的實(shí)驗步驟,就是從1堆蛋白質(zhì)里把亞硝基化修飾的蛋

白分揀出來(lái)進(jìn)行抗體檢測。不要忘了哦,此時(shí),那些原本亞硝基化修飾的蛋白質(zhì)早已被換

成了帶有?;锼貥撕灥牡鞍?,找出它們可1點(diǎn)也不難。

我們用1種填料親和素-agarose 制備成親和層析小柱,這可是個(gè)很高大上的玩意,可以把帶

有?;锼貥撕灥牡鞍捉y統結合上去。

將溶解沉淀蛋白的 HENS 液灌注親和素-agarose 洗脫柱,循環(huán)多次,并用洗脫液沖洗灌注親和

-agarose 洗脫柱(確保洗脫液充滿(mǎn)整個(gè)柱體),在 100時(shí)處理 20 分鐘后,打開(kāi)親和素-

agarose 洗脫柱下蓋,收集含目標蛋白洗脫液,并且用洗脫液繼續沖洗 2~3 次。收集蛋白。

?;?/span>-生物素交換法的步驟雖然比較復雜,但是并不需要特殊的實(shí)驗設備,屬于成本不高但

逼格很高?;旧峡梢宰?WESTERN BLOTTING 實(shí)驗的實(shí)驗室都可以做這方面的研究。

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而且,做疾病模型中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的文章還不算很多,相當搶手,可以多多關(guān)注哦。

注意事項:

不是所有蛋白都會(huì )發(fā)生亞硝基化修飾。先做好文獻調研。維生素 C 還原處理的時(shí)間不宜太長(cháng)。

Biotin–HPDP 配成儲液后分裝成小支。

丙酮沉淀蛋白后要盡量吹干或揮干里面的丙酮殘留。

親和素-agarose 洗脫柱填裝制備時(shí)要注意推平,不要產(chǎn)生縫隙或氣泡。

如果對該技術(shù)有興趣,推薦幾篇文獻看1看:

1.ffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH (2001) Protein S-nitrosylation: a

physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol 3:193–197.

2.ffrey SR, Fang M, Snyder SH (2002) Nitrosopeptide mapping: a novel methodology reveals S

nitrosylation of dexras1 on a single cysteine residue. Chem Biol 9:1329 –1335.

3.stafa AK, Kumar M, Selvakumar B, Ho GP, Ehmsen JT, Barrow RK, Amzel LM, and Snyder SH (2007).

Nitric oxide S-nitrosylates serine racemase, mediating feedback inhibition of D-serine formation.

Proc Natl Acad Sci USA 104: 2950-2955.

 

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