動(dòng)物基因組 DNA 的提取

[實(shí)驗原理]

在 EDTA 和 SDS 等去污劑存在下，用蛋白酶 K 消化細胞，隨后用酚抽提，可以得到哺乳

動(dòng)構基因組 DNA，用此方法得到的 DNA 長(cháng)度為 100-150 kb，適用于 L 嘴菌體構建基因組

文庫和 Southern 分析。

通過(guò)本實(shí)驗了解并掌握提取基因組 DNA 的原理和步驟，以及相對分子質(zhì)量較大的 DNA

的 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。

[儀器、材料與試劑]

(一)儀器

1.臺式離心機

2.玻璃勻漿器

3．高壓滅菌鍋

4．恒溫水浴

(二)材料

1．1.5mL 微量離心管

2．微量取樣器和吸頭

3．無(wú)菌過(guò)濾器(一次性)

4．10 mL 注射器

5．鼠肝

6．三羥甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸鈉(SDS)

8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶 K

10．RNA 酶

11．DNA 相對分子質(zhì)量標準物，DNA／EcoRI+HindⅢ相對分子質(zhì)量標準物

(三)試劑

1、1.5 mol／L NaCl

2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0

3．0.5 mol／L EDTA pH8.0

4．3 mol／L NaAc pH5.2

以上均高壓滅菌。

5．蛋白酶 K 10mg／mL 配好后用一次性過(guò)濾器過(guò)濾，-20 保存(教師配制)

6.組織勻漿液 100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／

LEDTA(pH8.0)

7．酶解液 200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH

8.0)，200~g／mL 蛋白酶 K，1％SDS

8．無(wú) DNA 酵的 RNA 酶 ： 將胰 RNA 酶溶解于 10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol

／L NaCl 溶液中，濃度 l0mg／mL，于 100℃水浴處理 15min，以降解 DNA 酶，緩慢冷

卻到室溫，-20℃保存

9．TE 緩沖液 ：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)

10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：異戊醇=25：24：1<體積比)

11．氧仿：異戊醇=24：l(體積比)

12．5xTBE 5．4gTris，2．75g 硼酸 2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到 100mL；

13．6x 上樣緩沖液 o．25％溴酚藍，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ 相對分于質(zhì)量標準物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，

3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

[實(shí)驗步驟]

本實(shí)驗在無(wú)液氮的條件下，鍘備鼠肝 DNA，與有液氮條件下相比，產(chǎn)量和質(zhì)量都有所下

降。整個(gè)操作過(guò)程中，應盡量避免 DNA 酶的污染，特 g4 注童動(dòng)作溫和，減少對 DNA 的

機械捌傷。

1、取 0.2g 鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗 3 次，然后置于 2.0mL 勻漿掖中，用玻璃勻漿器勻

漿至無(wú)明顯組織塊存在(冰浴操作，切匆將細胞破碎，可鏡檢觀(guān)察)。

2、將組織細胞移至 1.5ml 離心管中，50000rpm 離心 30-60sec，(盡可能在低溫下操作)，

棄上清，若沉淀中血細胞較多，可再加入 1 倍于細胞體積的勻漿液洗一次。

3、沉淀加 0.8mL 無(wú)菌水迅速吹散，分兩管，再加 0.4mL 酵解液，翻轉混勻(動(dòng)作一定要

輕)55℃水浴處理 12-18 h；

4、沉淀加 RNase 至終濃度 200µg／mL，37℃水浴 1 h；

5、加入等體積酚／lv仿／異戊醇抽提一次，(慢慢旋轉混勾，傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、

10min、10000rpm 離心；

6、有時(shí)如果 DNA 含量過(guò)高，水相在下層，實(shí)驗時(shí)應注意觀(guān)察。用擴口吸頭移出含 DNA

的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等體積氧仿／異戊醇，4℃、

10 000rrpm 離心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重復 1．6 操作)。

7、用擴口吸頭小心吸出上層含 DNA 的水相，加 1／10 體積的 NaAc，小心混勻(要充分)，

再向每管中加入 2.5 倍體積的無(wú)水乙醇，-20 過(guò)夜。8、12 000rpm 離心 19min，棄上清，75％冷乙醇洗滌一次，12000rpm 離心 15min 室

握溫干燥(不要大干，否則 DNA 不易溶解)，加入適量 TE 緩沖液，存放于 4℃，輕搖溶解過(guò)

夜，即可得 到實(shí)驗動(dòng)物基因組 DNA。

9、電泳鑒定 DNA，由于基因組 DNA 相對分子質(zhì)量較大，用 0.3％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，

先在底部錦一層 1％的支持膠，凝固后再鋪上一層 0.3％瓊脂糖凝膠，插上梳子(枚子不能瑾

到的支持膠)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上樣緩沖液和 35µl 無(wú)菌水混勻后小心上樣(可在

另一孔加 DNA 相對分于質(zhì)量標準)，觀(guān)察基因組 DNA 大小，用溴化乙錠染色觀(guān)察結果。

[注意事項]

1、操作過(guò)程盡量在低溫下進(jìn)行，避免 DNA 降解。

2、瓊脂糖凝膠脆弱，應小心操作。

3、提取得到的基因組 DNA 應為單一條帶，DNA 降解可形成彌散帶型。