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一、定點(diǎn)突變的目的
把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。
二、定點(diǎn)突變的原理
通過(guò)設計引物,并利用 PCR 將模板擴增出來(lái),然后去掉模板,剩下來(lái)的就是我們的 PCR
產(chǎn)物,在 PCR 產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了,然后再轉化,篩選陽(yáng)性克隆,再測序確定
就行了。
三、引物設計原則
引物設計的一般原則不再重復。
突變引物設計的特殊原則:
(1)通常引物長(cháng)度為 25~45 bp,我們建議引物長(cháng)度為 30~35 bp。一般都是以要突
變的堿基為中心,加上兩邊的一段序列,兩邊長(cháng)度至少為 11-12 bp。若兩邊引物太短了,
很可能會(huì )造成突變實(shí)驗失敗,因為引物至少要 11-12 個(gè) bp 才能與模板搭上,而這種突變
PCR 要求兩邊都能與引物搭上,所以?xún)蛇叡M量各設至少 12 個(gè) bp,并且合成多一條反向互
補的引物。
(2)如果設定的引物長(cháng)度為 30 bp,接下來(lái)需要計算引物的 Tm 值,看是否達到 78℃
(GC 含量應大于 40%)。
(3)如果 Tm 值低于 78℃,則適當改變引物的長(cháng)度以使其 Tm 值達到 78℃(GC 含
量應大于 40%)。
(4)設計上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。
(5)盡量使用經(jīng)過(guò)純化的引物。
Tm 值計算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注:L:引物堿基數;% of GC:引物 GC 含量。
四、引物設計實(shí)例
以 GCG→ACG 為例:
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
(1)首先設計 30 bp 長(cháng)的上下游引物,并將 A (T)設計在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
(2)引物GC含量為40%,
L為30,將這兩個(gè)數值帶入Tm值計算公式,得到其Tm=75.5
(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通過(guò)計算可以看出其 Tm 低于 78℃,這樣的引物是不合
適的,所以必須調整引物長(cháng)度。
(3)重新調整引物長(cháng)度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物兩端加 5mer(斜體下劃線(xiàn)處),這樣引物的 GC 含量為 45.7%,L 值為 35,將
這兩個(gè)數值帶入 Tm 值計算公式,得到其 Tm 為 80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),
這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗了。
五、突變所用聚合酶及 Buffer
引物和質(zhì)粒都準備好后,當然就是做 PCR 嘍,不過(guò)對于 PCR 的酶和 buffer,不能用平
時(shí)的,我們做 PCR 把整個(gè)質(zhì)粒擴出來(lái),延伸長(cháng)度達到幾個(gè) K,所以要用那些 GC buffer 或
擴增長(cháng)片段的 buffer,另外,要用保真性能較好的 PFU 酶來(lái)擴增,防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變試劑盒,如 Stratagene 和塞百盛的試劑盒,但價(jià)格昂貴??梢?
使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金pai快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTM HS DNA
polymerase。
六、如何去掉 PCR 產(chǎn)物
zui簡(jiǎn)單的方法就是用 DpnI 酶,DpnI 能夠識別甲基化位點(diǎn)并將其酶切,我們用的模板
一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒,從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護起來(lái)(除非你用
的是甲基化缺陷型的菌株),而 PCR 產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的,所以 DpnI 酶能夠特異性地切
割模板(質(zhì)粒)而不會(huì )影響 PCR 產(chǎn)物,從而去掉模板留下 PCR 產(chǎn)物,所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌
株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI 處理的時(shí)間盡量長(cháng)一點(diǎn),少一個(gè)小時(shí)吧,盡量能有兩三個(gè)小時(shí),因為如果模板
處理得不干凈,哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn),模板直接在平板上長(cháng)出來(lái),就會(huì )導致實(shí)驗失敗。
七、如何拿到質(zhì)粒
直接把通過(guò) DpnI 處理的 PCR 產(chǎn)物拿去做轉化就行了,然后再篩選出陽(yáng)性克隆,并提
出質(zhì)粒,拿去測序,驗證突變結果。
八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟
[A] 誘導突變基因(PCR 反應)以待突變的質(zhì)粒為模板,用設計的引物及 Muta-direct™
酶進(jìn)行 PCR 擴增反應,誘導目的基因突變。
1. 設計點(diǎn)突變引物。
[注]參考引物設計指導
2. 準備模板質(zhì)粒 DN A
[注]用 dam+型菌株(例如 DH5α 菌株)作為宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆數低的現
象,但是對突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒 DNA 時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純試劑盒。
3. [選項]對照反應體系(50μl 反應體系)
10×Reaction Buffer
5μl
pUC18 control plasmid(10ng/μl,total
20ng)
2μlControl primer mix(20pmol/μl)
2μl
dNTP mixture(each 2.5mM)
2μl
dH2O
38μl
Muta-direct™ Enzyme
1μl
4. 樣品反應體系(50μl 反應體系)
10×Reaction Buffer
5μl
Sample plasmid(10ng/μl,total
20ng)
2μl
Sample primer (F)(10pmol/μl)
1μl
Sample primer (R)(10pmol/μl)
1μl
dNTP mixture(each 2.5mM)
2μl
dH2O
38μl
Muta-direct™ Enzyme
1μl
5. PCR 反應條件
[注]按如下參數設置 PCR 擴增條件。
Cycles
Temperature
Reaction Time
1cycle
95℃
30sec15cycle
95℃
30sec
55℃
1min
72℃
1min per plasmid Kb
6. PCR 擴增反應完成后冰育 5 分鐘,然后置于室溫(避免反復凍融)。
[注] 按下列提供的 PCR 條件進(jìn)行擴增,控制 PCR 循環(huán)數。注意當突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò) 4 個(gè)時(shí)
會(huì )發(fā)生突變率降低的現象。
Mutation
Cycles
1~2Nucleotide
15cycles
3Nucleotides
18cycles
[B] 突變質(zhì)粒選擇
PCR 反應結束后使用 Mutazyme™酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒 DNA。
1. 準備 PCR 反應產(chǎn)物
2. 加入 1μl(10U/μl)Mutazyme™酶 37℃溫育 1 小時(shí)。
[注]當質(zhì)粒 DNA 用量過(guò)多時(shí) Mutazyme™酶可能發(fā)生與樣品反應不*的現象。因此我們
建議為了保證突變率請嚴格遵照實(shí)驗步驟進(jìn)行操作。如果突變率低,可以適當延長(cháng)反應時(shí)間
或增加 Mutazyme™酶用量。
[C]轉化
反應完畢后在質(zhì)粒 DNA 上會(huì )產(chǎn)生缺口,當把這個(gè)質(zhì)粒 DNA 轉入 E.coli 中時(shí)請選擇 dam+
型菌株,例如 DH5α。
1. 將 10μl 樣品加到 50μl 感受態(tài)細胞里,然后放置在冰上 30 分鐘。
2. 接下來(lái)可以參照一般的轉化步驟進(jìn)行。序列分析
通常當 LB 平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。
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