一、定點(diǎn)突變的目的

把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。

二、定點(diǎn)突變的原理

通過(guò)設計引物，并利用 PCR 將模板擴增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的 PCR

產(chǎn)物，在 PCR 產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉化，篩選陽(yáng)性克隆，再測序確定

就行了。

三、引物設計原則

引物設計的一般原則不再重復。

突變引物設計的特殊原則：

（1）通常引物長(cháng)度為 25~45 bp，我們建議引物長(cháng)度為 30~35 bp。一般都是以要突

變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(cháng)度至少為 11-12 bp。若兩邊引物太短了，

很可能會(huì )造成突變實(shí)驗失敗，因為引物至少要 11-12 個(gè) bp 才能與模板搭上，而這種突變

PCR 要求兩邊都能與引物搭上，所以?xún)蛇叡M量各設至少 12 個(gè) bp，并且合成多一條反向互

補的引物。

（2）如果設定的引物長(cháng)度為 30 bp，接下來(lái)需要計算引物的 Tm 值，看是否達到 78℃

（GC 含量應大于 40%）。

（3）如果 Tm 值低于 78℃，則適當改變引物的長(cháng)度以使其 Tm 值達到 78℃（GC 含

量應大于 40%）。

（4）設計上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。

（5）盡量使用經(jīng)過(guò)純化的引物。

Tm 值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物堿基數；% of GC：引物 GC 含量。

四、引物設計實(shí)例

以 GCG→ACG 為例：

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

（1）首先設計 30 bp 長(cháng)的上下游引物，并將 A (T)設計在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

（2）引物GC含量為40%，

L為30，將這兩個(gè)數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5

（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過(guò)計算可以看出其 Tm 低于 78℃，這樣的引物是不合

適的，所以必須調整引物長(cháng)度。

（3）重新調整引物長(cháng)度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物兩端加 5mer（斜體下劃線(xiàn)處），這樣引物的 GC 含量為 45.7%，L 值為 35，將

這兩個(gè)數值帶入 Tm 值計算公式，得到其 Tm 為 80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），

這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗了。

五、突變所用聚合酶及 Buffer

引物和質(zhì)粒都準備好后，當然就是做 PCR 嘍，不過(guò)對于 PCR 的酶和 buffer，不能用平

時(shí)的，我們做 PCR 把整個(gè)質(zhì)粒擴出來(lái)，延伸長(cháng)度達到幾個(gè) K，所以要用那些 GC buffer 或

擴增長(cháng)片段的 buffer，另外，要用保真性能較好的 PFU 酶來(lái)擴增，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變試劑盒，如 Stratagene 和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴?？梢?

使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金pai快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTM HS DNA

polymerase。

六、如何去掉 PCR 產(chǎn)物

zui簡(jiǎn)單的方法就是用 DpnI 酶，DpnI 能夠識別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板

一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護起來(lái)（除非你用

的是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR 產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以 DpnI 酶能夠特異性地切

割模板（質(zhì)粒）而不會(huì )影響 PCR 產(chǎn)物，從而去掉模板留下 PCR 產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌

株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI 處理的時(shí)間盡量長(cháng)一點(diǎn)，少一個(gè)小時(shí)吧，盡量能有兩三個(gè)小時(shí)，因為如果模板

處理得不干凈，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(cháng)出來(lái)，就會(huì )導致實(shí)驗失敗。

七、如何拿到質(zhì)粒

直接把通過(guò) DpnI 處理的 PCR 產(chǎn)物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提

出質(zhì)粒，拿去測序，驗證突變結果。

八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟

[A] 誘導突變基因（PCR 反應）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設計的引物及 Muta-direct™

酶進(jìn)行 PCR 擴增反應，誘導目的基因突變。

1. 設計點(diǎn)突變引物。

[注]參考引物設計指導

2. 準備模板質(zhì)粒 DN A

[注]用 dam+型菌株（例如 DH5α 菌株）作為宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆數低的現

象，但是對突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒 DNA 時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純試劑盒。

3. [選項]對照反應體系（50μl 反應體系）

10×Reaction Buffer

5μl

pUC18 control plasmid（10ng/μl，total

20ng）

2μlControl primer mix（20pmol/μl）

2μl

dNTP mixture（each 2.5mM）

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

4. 樣品反應體系（50μl 反應體系）

10×Reaction Buffer

5μl

Sample plasmid（10ng/μl，total

20ng）

2μl

Sample primer (F)（10pmol/μl）

1μl

Sample primer (R)（10pmol/μl）

1μl

dNTP mixture（each 2.5mM）

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

5. PCR 反應條件

[注]按如下參數設置 PCR 擴增條件。

Cycles

Temperature

Reaction Time

1cycle

95℃

30sec15cycle

95℃

30sec

55℃

1min

72℃

1min per plasmid Kb

6. PCR 擴增反應完成后冰育 5 分鐘，然后置于室溫（避免反復凍融）。

[注] 按下列提供的 PCR 條件進(jìn)行擴增，控制 PCR 循環(huán)數。注意當突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò) 4 個(gè)時(shí)

會(huì )發(fā)生突變率降低的現象。

Mutation

Cycles

1~2Nucleotide

15cycles

3Nucleotides

18cycles

[B] 突變質(zhì)粒選擇

PCR 反應結束后使用 Mutazyme™酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒 DNA。

1. 準備 PCR 反應產(chǎn)物

2. 加入 1μl（10U/μl）Mutazyme™酶 37℃溫育 1 小時(shí)。

[注]當質(zhì)粒 DNA 用量過(guò)多時(shí) Mutazyme™酶可能發(fā)生與樣品反應不*的現象。因此我們

建議為了保證突變率請嚴格遵照實(shí)驗步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當延長(cháng)反應時(shí)間

或增加 Mutazyme™酶用量。

[C]轉化

反應完畢后在質(zhì)粒 DNA 上會(huì )產(chǎn)生缺口，當把這個(gè)質(zhì)粒 DNA 轉入 E.coli 中時(shí)請選擇 dam+

型菌株，例如 DH5α。

1. 將 10μl 樣品加到 50μl 感受態(tài)細胞里，然后放置在冰上 30 分鐘。

2. 接下來(lái)可以參照一般的轉化步驟進(jìn)行。序列分析

通常當 LB 平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。