單核苷酸多態(tài)性（SNP）實(shí)驗

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導

致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據估計，在人類(lèi)基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一

個(gè) SNP，無(wú)論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微衛星標記(STR)，都要廣泛得多。

實(shí)驗方法原理：

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導

致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據估計，在人類(lèi)基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一

個(gè) SNP，無(wú)論是比較于限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP)分析還是微衛星標記(STR)，都要廣泛

得多。SNP 是我們考察遺傳變異的小單位,據估計，人類(lèi)的所有群體中大約存在一千萬(wàn)個(gè)

SNP 位點(diǎn)。一般認為，相鄰的 SNPs 傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上

某一區域的一組相關(guān)聯(lián)的 SNP 等位位點(diǎn)稱(chēng)作單體型（haplotype）。大多數染色體區域只有

少數幾個(gè)常見(jiàn)的單體型（每個(gè)具有至少 5%的頻率），它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的

大部分多態(tài)性。一個(gè)染色體區域可以有很多 SNP 位點(diǎn)，但是我們一旦掌握了這個(gè)區域的單

體型，就可以只使用少數幾個(gè)標簽 SNPs(tagSNP)來(lái)進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)

模式。

實(shí)驗材料：

組織樣品

試劑、試劑盒：

液氮、PBS、GA 緩沖液、GB 緩沖液、蛋白酶 K、無(wú)水乙醇、蛋白液、漂洗液等

儀器、耗材：

離心管、離心機、廢液收集管、吸附柱、水浴鍋、分光光度計、低溫冰箱等

實(shí)驗步驟：一、DNA 抽提

1. 取新鮮肌肉組織約 100 mg，PBS 漂洗干凈，置于 1.5 ml 離心管中，加入液氮，迅速

磨碎。

2. 加 200 μl 緩沖液 GA，震蕩至*懸浮。加入 20 μl 蛋白酶 K（20 mg/ml）溶液，

混勻。

3. 加 220 μl 緩沖液 GB，充分混勻，37℃消化過(guò)夜，溶液變清亮。加 220 μl 無(wú)水乙醇，

充分混勻，此時(shí)可能會(huì )出現絮狀沉淀。

4. 將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱 CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）

12 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。

5. 加入 500 μl 去蛋白液 GD（使用前請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 rpm 離心

30 秒，棄掉廢液。

6. 加入 700 μl 漂洗液 GW（使用前請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12 000 rpm 離心

30 秒，棄掉廢液。加入 500 μl 漂洗液 GW，12 000 rpm 離心 30 秒，棄掉廢液。將吸

附柱 CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心 2 分鐘，盡量除去漂洗液。

7. 將吸附柱 CB 轉入一個(gè)干凈的離心管中，加入 100 μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在

60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置 15 分鐘，12 000 rpm 離心 30 秒。洗脫第二次，

將洗脫緩沖液 50 μl 加入吸附柱中，室溫放置 15 分鐘，12 000 rpm 離心 30 秒。

8. 采用 Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組 DNA 濃度，在

OD260 處有顯著(zhù)吸收峰。同時(shí)檢測純度，OD260/280 的值應為為 1.7-1.9。

9. 從原液中取出相應體積 DNA 溶液，稀釋致 50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置

于-20℃保存。

二、 PCR 擴增目的片段1. 按相關(guān)的試劑說(shuō)明在標準反應管中準備反應體系，典型的 PCR 反應體系如下（20 ul

體系）：

2. 向左扳動(dòng)儀器蓋子上的手柄，揭開(kāi)儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，

輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。

三、 在 T1 型 PCR 儀上編輯一個(gè)程序

1. 按[C programs]進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng )建一個(gè)程序請按[D enter]。要進(jìn)入一

個(gè)子目錄，用→鍵將光標向右移動(dòng)，然后用↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄。按[D enter]進(jìn)入選擇的

子目錄。

2. 輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時(shí)間，用小數點(diǎn)來(lái)間隔。順序

為 h.m.s。用[D enter]確認時(shí)間設置，或者用光標鍵移動(dòng)到下一個(gè)區域。＃表示循環(huán)的次數。

設定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數為 30 時(shí)應輸入“29”。用[C pgm ok]來(lái)儲存一個(gè)

完整的程序。程序數據長(cháng)期的儲存在記憶中。

四、運行程序

按[B start/stop]選擇一個(gè)程序。用→↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄，或者用[D enter]進(jìn)入主目錄。

輸入您想要啟動(dòng)的程序的號碼?；蛘?，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個(gè)

程序。用↑↓鍵在列表中滾動(dòng)選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動(dòng)程

序。

五、控制測試過(guò)程運行過(guò)程中，按 A 按鈕，可以獲得程序剩余的時(shí)間信息。運行完成后，按 STOP 按鈕終止

實(shí)驗，按 YES 確認終止。小心旋開(kāi)熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開(kāi)蓋子，取出實(shí)驗

樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實(shí)驗結束。

六、PCR 產(chǎn)物測序

由專(zhuān)門(mén)負責測序的服務(wù)公司完成。

七、數據分析

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發(fā)現的 SNP 在基因組中的位置：重點(diǎn)是啟動(dòng)子區、

外顯子區域（包括編碼區的 cSNP 及 5’及 3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導

致氨基酸的改變：錯義突變、無(wú)義突變、終止突變。

注意事項：

1. 為保證待測目的區域測序真實(shí)可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物

至少各 50 bp；

2. 引物設計建議使用在線(xiàn)方式，以保證成功率；

3. 為保證測序敏感性，PCR 產(chǎn)物片段大小應在 250 bp－650 bp 范圍；

4. 為方便實(shí)驗，建議引物合成時(shí)分裝成 1 o.d/管，方便將 PCR 與測序的引物分開(kāi)；

5. 為保證引物的特異性，建議引物設計后在 NCBI 上 blast 確認；

6. 為防止降解，PCR 產(chǎn)物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)；

7. 為保證結果真實(shí)性，建議對關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行反向測序確認。