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變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種根據 DNA 的片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統。核
酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈,稱(chēng)之為變性。核酸 50%發(fā)生變性時(shí)的溫度稱(chēng)為熔
解溫度(Tm)。Tm 值主要取決于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 將凝膠設置在雙重
變性條件下:溫度 50~60 ℃,變性劑 0~100%。當一雙鏈 DNA 的片段通過(guò)一變性劑濃度呈
梯度增加的凝膠時(shí),此片段遷移至某一點(diǎn)變性劑濃度恰好相當于此段 DNA 的低熔點(diǎn)區的
Tm 值,此區便開(kāi)始熔解,而高熔點(diǎn)區仍為雙鏈。這種局部解鏈的 DNA 分子遷移率發(fā)生改
變,達到分離的效果。Tm 的改變依賴(lài)于 DNA 序列,即使一個(gè)堿基的替代就可引起 Tm 值
的升高和降低。因此,DGGE 可以檢測 DNA 分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以
及少于 10 個(gè)堿基的缺失突變。
詳細
實(shí)驗方法
• 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
實(shí)驗材料
• DNA 樣品
試劑、試劑盒
• 尿素
• 去離子甲酰胺
• 丙烯酰胺
• 甲叉雙丙烯酰胺
• 瓊脂糖
儀器、耗材• PCR 擴增儀
• 變性梯度凝膠電泳儀
• 凝膠成像及分析系統
• 紫外透射儀
• 高速離心機
• 電泳儀
• 電泳槽
• 微量加樣器
• Tip 頭
• Tip 頭盒
• Eppendorf 管
• Eppendorf 管架
一、實(shí)驗原理
變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種根據 DNA 的片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統。核
酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈,稱(chēng)之為變性。核酸 50%發(fā)生變性時(shí)的溫度稱(chēng)為熔
解溫度(Tm)。Tm 值主要取決于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 將凝膠設置在雙重
變性條件下:溫度 50~60 ℃,變性劑 0~100%。當一雙鏈 DNA 的片段通過(guò)一變性劑濃度呈
梯度增加的凝膠時(shí),此片段遷移至某一點(diǎn)變性劑濃度恰好相當于此段 DNA 的低熔點(diǎn)區的
Tm 值,此區便開(kāi)始熔解,而高熔點(diǎn)區仍為雙鏈。這種局部解鏈的 DNA 分子遷移率發(fā)生改
變,達到分離的效果。Tm 的改變依賴(lài)于 DNA 序列,即使一個(gè)堿基的替代就可引起 Tm 值
的升高和降低。因此,DGGE 可以檢測 DNA 分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以
及少于 10 個(gè)堿基的缺失突變。為了提高 DGGE 的突變檢出率,可以人為地加入一個(gè)高熔點(diǎn)區——GC 夾。GC 夾(GC
clamp)就是在一側引物的 5′端加上一個(gè) 30~40bp 的 GC 結構,這樣在 PCR 產(chǎn)物的一側
可產(chǎn)生一個(gè)高熔點(diǎn)區,使相應的感興趣的序列處于低熔點(diǎn)區而便于分析。因此,DGGE 的突
變檢出率可提高到接近于 100%。
作為一種突變檢測技術(shù),DGGE 具有如下的優(yōu)點(diǎn):(1)突變檢出率高。DGGE 的突變檢出
率為 99%以上。(2)檢測片段長(cháng)度可達 1kb,尤其適用于 100~500bp 的片段。(3)非
同位素性。DGGE 不需同位素摻入,可避免同位素污染及對人體造成的傷害。(4)操作簡(jiǎn)
便、快速。DGGE 一般在 24 小時(shí)內即可獲得結果。(5)重復性好。但是,該方法需要特
殊的儀器,而且合成帶 GC 夾的引物也比較昂貴。
二、實(shí)驗用品
1.PCR 擴增儀;變性梯度凝膠電泳儀;凝膠成像及分析系統;紫外透射儀;高速離心機;
電泳儀;電泳槽。
2.尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖
3.微量加樣器(200μl,20μl);Tip 頭(200μl,20μl)。Tip 頭盒(200μl,20μl);
Eppendorf 管(0.5ml,0.2ml),Eppendorf 管架。
4.PCR 擴增相關(guān)試劑
三、實(shí)驗步驟
1.PCR 反應(同前)
其中,上游引物加 40bp [GC] Clamp。
2.PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認。
3.垂直變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為 6%聚丙烯酰胺凝膠,變性濃度為 0~
100%。其中,含 7 M 尿素和 40%去離子甲酰胺的膠為 100%變性,不含尿素和去離子甲
酰胺的膠為 0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的適解鏈條件(即變性濃
度)。
PCR 產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣,300~400μl/孔,電壓 150V,溫度 60℃,時(shí)間 2~4 小時(shí)。
4.平行變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃
度,制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠,檢測各標本是否存在突變。
PCR 產(chǎn)物加上樣緩沖液后,25μl~30μl/孔,電壓 150V,溫度 60℃,時(shí)間 3~6 小時(shí)。
5.染色 5 分鐘,凝膠成像儀分析結果。
四、注意事項
1、該實(shí)驗中提取 DNA,以及 DGGE 操作中接觸到得很多藥品都有毒,還有致癌、變性等
毒害,一定要嚴格操作,做好防護保護自己。
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