變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據 DNA 的片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統。核

酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱(chēng)之為變性。核酸 50%發(fā)生變性時(shí)的溫度稱(chēng)為熔

解溫度（Tm）。Tm 值主要取決于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 將凝膠設置在雙重

變性條件下：溫度 50~60 ℃，變性劑 0~100%。當一雙鏈 DNA 的片段通過(guò)一變性劑濃度呈

梯度增加的凝膠時(shí)，此片段遷移至某一點(diǎn)變性劑濃度恰好相當于此段 DNA 的低熔點(diǎn)區的

Tm 值，此區便開(kāi)始熔解，而高熔點(diǎn)區仍為雙鏈。這種局部解鏈的 DNA 分子遷移率發(fā)生改

變，達到分離的效果。Tm 的改變依賴(lài)于 DNA 序列，即使一個(gè)堿基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此，DGGE 可以檢測 DNA 分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以

及少于 10 個(gè)堿基的缺失突變。

詳細

實(shí)驗方法

• 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

實(shí)驗材料

• DNA 樣品

試劑、試劑盒

• 尿素

• 去離子甲酰胺

• 丙烯酰胺

• 甲叉雙丙烯酰胺

• 瓊脂糖

儀器、耗材• PCR 擴增儀

• 變性梯度凝膠電泳儀

• 凝膠成像及分析系統

• 紫外透射儀

• 高速離心機

• 電泳儀

• 電泳槽

• 微量加樣器

• Tip 頭

• Tip 頭盒

• Eppendorf 管

• Eppendorf 管架

一、實(shí)驗原理

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據 DNA 的片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統。核

酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱(chēng)之為變性。核酸 50%發(fā)生變性時(shí)的溫度稱(chēng)為熔

解溫度（Tm）。Tm 值主要取決于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 將凝膠設置在雙重

變性條件下：溫度 50~60 ℃，變性劑 0~100%。當一雙鏈 DNA 的片段通過(guò)一變性劑濃度呈

梯度增加的凝膠時(shí)，此片段遷移至某一點(diǎn)變性劑濃度恰好相當于此段 DNA 的低熔點(diǎn)區的

Tm 值，此區便開(kāi)始熔解，而高熔點(diǎn)區仍為雙鏈。這種局部解鏈的 DNA 分子遷移率發(fā)生改

變，達到分離的效果。Tm 的改變依賴(lài)于 DNA 序列，即使一個(gè)堿基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此，DGGE 可以檢測 DNA 分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以

及少于 10 個(gè)堿基的缺失突變。為了提高 DGGE 的突變檢出率，可以人為地加入一個(gè)高熔點(diǎn)區——GC 夾。GC 夾（GC

clamp）就是在一側引物的 5′端加上一個(gè) 30~40bp 的 GC 結構，這樣在 PCR 產(chǎn)物的一側

可產(chǎn)生一個(gè)高熔點(diǎn)區，使相應的感興趣的序列處于低熔點(diǎn)區而便于分析。因此，DGGE 的突

變檢出率可提高到接近于 100%。

作為一種突變檢測技術(shù)，DGGE 具有如下的優(yōu)點(diǎn)：（1）突變檢出率高。DGGE 的突變檢出

率為 99%以上。（2）檢測片段長(cháng)度可達 1kb，尤其適用于 100~500bp 的片段。（3）非

同位素性。DGGE 不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡(jiǎn)

便、快速。DGGE 一般在 24 小時(shí)內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特

殊的儀器，而且合成帶 GC 夾的引物也比較昂貴。

二、實(shí)驗用品

1．PCR 擴增儀；變性梯度凝膠電泳儀；凝膠成像及分析系統；紫外透射儀；高速離心機；

電泳儀；電泳槽。

2．尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖

3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip 頭（200μl，20μl）。Tip 頭盒（200μl，20μl）；

Eppendorf 管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf 管架。

4．PCR 擴增相關(guān)試劑

三、實(shí)驗步驟

1．PCR 反應（同前）

其中，上游引物加 40bp [GC] Clamp。

2．PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認。

3．垂直變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為 6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為 0～

100%。其中，含 7 M 尿素和 40%去離子甲酰胺的膠為 100%變性，不含尿素和去離子甲

酰胺的膠為 0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的適解鏈條件（即變性濃

度）。

PCR 產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，300～400μl/孔，電壓 150V，溫度 60℃，時(shí)間 2～4 小時(shí)。

4．平行變性梯度凝膠電泳

變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃

度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。

PCR 產(chǎn)物加上樣緩沖液后，25μl～30μl/孔，電壓 150V，溫度 60℃，時(shí)間 3～6 小時(shí)。

5．染色 5 分鐘，凝膠成像儀分析結果。

四、注意事項

1、該實(shí)驗中提取 DNA，以及 DGGE 操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等

毒害，一定要嚴格操作，做好防護保護自己。