DNA的瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗目的

瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗學(xué)習

DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù)，掌握有關(guān)的技術(shù)和識讀電泳圖譜的方法。

實(shí)驗原理

   瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方

法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應和分子篩效應，達到分離混

合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的

電場(chǎng)強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的

影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速

度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子

（cccDNA）、開(kāi)環(huán)分子(ocDNA)、和線(xiàn)形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進(jìn)行電

泳時(shí)的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

    核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團中只有一個(gè)磷

酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負極泳動(dòng)；而pH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而

磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大

致相同，因此對泳動(dòng)速度影響不大。在中性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(cháng)的雙鏈DNA的泳

動(dòng)率大致相同。

影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是：

1、樣品的物理性狀

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言，電荷密度愈大，泳動(dòng)率越大。但

是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動(dòng)率的影響不明顯。

對線(xiàn)形分子來(lái)說(shuō)，分子量的常用對數與泳動(dòng)率成反比，用此標準樣品電泳并測定其泳動(dòng)率，

然后進(jìn)行DNA分子長(cháng)度（bp）的負對數——泳動(dòng)距離作標準曲線(xiàn)圖，可以用于測定未知

分子的長(cháng)度大小。

DNA分子的空間構型對泳動(dòng)率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的大小順序為：cDNA

＞IDNA＞ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場(chǎng)強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會(huì )出

現相反的情況。

2、支持物介質(zhì)

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線(xiàn)性分子。

含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是于分離不同濃度范圍的核酸

分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過(guò)硫酸銨

（AP）的催化下聚合形成長(cháng)鏈，并通過(guò)交聯(lián)劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，

其網(wǎng)孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長(cháng)度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp）

的分離效果好。選擇不同濃度的凝膠，可以分離不同大小范圍的DNA分子。

3、電場(chǎng)強度

電場(chǎng)強度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著(zhù)電壓增大而減小，所以電

泳時(shí)一般采用低電壓，不超過(guò)4V/cm。而對于大片段電泳，甚至用0.5-1.0V/cm電泳過(guò)夜。

進(jìn)行高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。

4、緩沖液離子強度

核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統，但它們各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖

能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì )使DNA污染磷酸鹽，

影響后續反應。所以多采用TBE緩沖液。

在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制DNase，保護DNA。

緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負電，向正極移動(dòng)。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分

子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線(xiàn)照射BE-DNA復合物時(shí)，出現不同的效

應。254nm的紫外線(xiàn)照射時(shí)，靈敏度高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線(xiàn)照射時(shí)，

雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀(guān)察和回收等操作。300nm

紫外線(xiàn)照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。

使用溴化乙錠對DNA樣品進(jìn)行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻

入DNA分子中，可以在電泳過(guò)程中隨時(shí)觀(guān)察核酸的遷移情況，但是如果要測定核酸分子大

小時(shí)，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結束后，把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中

10～30min進(jìn)行染色。BE見(jiàn)光分解，應在避光條件下4℃保存。

材料、試劑及器具

1、材料

1kbMarker（分子量標準）；DNA樣品

2、試劑

加樣緩沖液（6x）：0.25%溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）；酶液（10mg/ml）。

3、器具

（1）電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。

（2）紫外透射儀。

操作步驟

1、按所分離的DNA分子的大小范圍，稱(chēng)取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適

量的0.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至*溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。

冷卻至60℃左右，在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。 

2、取有機玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽

之間的縫隙。

3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液，使之形成均

勻水平的膠面。

4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內。

5、在槽內加入0.5×TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過(guò)膠面

6、把待檢測的樣品，按以下量在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。

1μl加樣緩沖液（6×）+5μl待測DNA樣品

〔+0.5μlEB液（10mg/ml）（注：若膠內未加EB，可選用此法）?！?/span>

7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調節穩壓輸出，電壓高不超過(guò)5V/cm，開(kāi)始電泳。

點(diǎn)樣端放陰。根據經(jīng)驗調節電壓使分帶清晰。

8、觀(guān)察溴酚蘭的帶（藍色）的移動(dòng)。當其移動(dòng)至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。

9、染色：把膠槽取出，小心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上，放進(jìn)EB

溶液中進(jìn)行染色，*浸泡約30min。

10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠

放在上面。關(guān)上樣品室外門(mén)，打開(kāi)紫外燈（360nm或254nm），通過(guò)觀(guān)察孔進(jìn)行觀(guān)察。

注意事項

1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心，勿沾染于衣物、

皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專(zhuān)門(mén)的電泳區域操作，戴一次性手套，并及時(shí)更換。

2、預先加入EB時(shí)可能使DNA的泳動(dòng)速度下降15%左右，而且對不同構型的DNA的影

響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結果可以在電泳結束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸

泡染色。若膠內或樣品內已加EB，染色步驟可省略；若凝膠放置一段時(shí)間后才觀(guān)察，即使

原來(lái)膠內或樣品已加EB，也建議增加此步。

3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除，否則，需重新制膠。

4、以 0.5×TBE作為電泳緩沖液時(shí)，溴酚蘭在0.5%～1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大約

相當于300bp的線(xiàn)性DNA的泳動(dòng)速度，而二甲苯青FF的泳動(dòng)速度相當于4Kb的雙鏈線(xiàn)

形DNA的泳動(dòng)速度。