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DNA的瓊脂糖凝膠電泳
實(shí)驗目的
瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法,具有操作方便、經(jīng)濟快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗學(xué)習
DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術(shù),掌握有關(guān)的技術(shù)和識讀電泳圖譜的方法。
實(shí)驗原理
瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法,這種電泳方
法以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應和分子篩效應,達到分離混
合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負電,在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的
電場(chǎng)強度下,DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的
影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速
度不同。如環(huán)形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子
(cccDNA)、開(kāi)環(huán)分子(ocDNA)、和線(xiàn)形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進(jìn)行電
泳時(shí)的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA
核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,而三個(gè)磷酸基團中只有一個(gè)磷
酸解離,所以分子帶正電,在電場(chǎng)中向負極泳動(dòng);而pH8.0-8.3時(shí),堿基幾乎不解離,而
磷酸基團解離,所以核酸分子帶負電,在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不同的核酸分子的電荷密度大
致相同,因此對泳動(dòng)速度影響不大。在中性或堿性時(shí),單鏈DNA與等長(cháng)的雙鏈DNA的泳
動(dòng)率大致相同。
影響核酸分子泳動(dòng)率的因素主要是:
1、樣品的物理性狀
即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言,電荷密度愈大,泳動(dòng)率越大。但
是不同核酸分子的電荷密度大致相同,所以對泳動(dòng)率的影響不明顯。
對線(xiàn)形分子來(lái)說(shuō),分子量的常用對數與泳動(dòng)率成反比,用此標準樣品電泳并測定其泳動(dòng)率,
然后進(jìn)行DNA分子長(cháng)度(bp)的負對數——泳動(dòng)距離作標準曲線(xiàn)圖,可以用于測定未知
分子的長(cháng)度大小。
DNA分子的空間構型對泳動(dòng)率的影響很大,比如質(zhì)粒分子,泳動(dòng)率的大小順序為:cDNA
>IDNA>ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場(chǎng)強度、離子強度和溴化乙錠等的影響,會(huì )出
現相反的情況。
2、支持物介質(zhì)
核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì),瓊脂糖是一種聚合鏈線(xiàn)性分子。
含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同,是于分離不同濃度范圍的核酸
分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和過(guò)硫酸銨
(AP)的催化下聚合形成長(cháng)鏈,并通過(guò)交聯(lián)劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)交叉連接而成,
其網(wǎng)孔的大小由Acr與Bis的相對比例決定。
瓊脂糖凝膠適合分離長(cháng)度100至60的分子,而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段(5bp-500bp)
的分離效果好。選擇不同濃度的凝膠,可以分離不同大小范圍的DNA分子。
3、電場(chǎng)強度
電場(chǎng)強度愈大,帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分離范圍隨著(zhù)電壓增大而減小,所以電
泳時(shí)一般采用低電壓,不超過(guò)4V/cm。而對于大片段電泳,甚至用0.5-1.0V/cm電泳過(guò)夜。
進(jìn)行高壓電泳時(shí),只能使用聚丙烯酰胺凝膠。
4、緩沖液離子強度
核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統,但它們各有利弊。TAE價(jià)格低廉,但緩沖
能力低,必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí),會(huì )使DNA污染磷酸鹽,
影響后續反應。所以多采用TBE緩沖液。
在緩沖液中加入EDTA,可以鰲合二價(jià)離子,抑制DNase,保護DNA。
緩沖液pH常偏堿性或中性,此時(shí)核酸分子帶負電,向正極移動(dòng)。
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(ethidium bromide EB)。溴化乙錠是一種扁平分
子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線(xiàn)照射BE-DNA復合物時(shí),出現不同的效
應。254nm的紫外線(xiàn)照射時(shí),靈敏度高,但對DNA損傷嚴重;360nm紫外線(xiàn)照射時(shí),
雖然靈敏度較低,但對DNA損傷小,所以適合對DNA樣品的觀(guān)察和回收等操作。300nm
紫外線(xiàn)照射的靈敏度較高,且對DNA損傷不是很大,所以也比較適用。
使用溴化乙錠對DNA樣品進(jìn)行染色,可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻
入DNA分子中,可以在電泳過(guò)程中隨時(shí)觀(guān)察核酸的遷移情況,但是如果要測定核酸分子大
小時(shí),不宜使用以上方法,而是應該在電泳結束后,把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中
10~30min進(jìn)行染色。BE見(jiàn)光分解,應在避光條件下4℃保存。
材料、試劑及器具
1、材料
1kbMarker(分子量標準);DNA樣品
2、試劑
加樣緩沖液(6x):0.25%溴酚蘭,40%蔗糖;瓊脂糖;溴化乙錠(EB);酶液(10mg/ml)。
3、器具
(1)電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
(2)紫外透射儀。
操作步驟
1、按所分離的DNA分子的大小范圍,稱(chēng)取適量的瓊脂糖粉末,放到一錐形瓶中,加入適
量的0.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至*溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。
冷卻至60℃左右,在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml。
2、取有機玻璃制膠板槽,有透明膠帶沿膠槽四周封嚴,并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽
之間的縫隙。
3、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液,使之形成均
勻水平的膠面。
4、.待膠凝固后,小心拔起梳子,撕下透明膠帶,使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內。
5、在槽內加入0.5×TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過(guò)膠面
6、把待檢測的樣品,按以下量在潔凈載玻片上小心混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
1μl加樣緩沖液(6×)+5μl待測DNA樣品
〔+0.5μlEB液(10mg/ml)(注:若膠內未加EB,可選用此法)?!?/span>
7、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節穩壓輸出,電壓高不超過(guò)5V/cm,開(kāi)始電泳。
點(diǎn)樣端放陰。根據經(jīng)驗調節電壓使分帶清晰。
8、觀(guān)察溴酚蘭的帶(藍色)的移動(dòng)。當其移動(dòng)至距膠板前沿約1cm處,可停止電泳。
9、染色:把膠槽取出,小心滑出膠塊,水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上,放進(jìn)EB
溶液中進(jìn)行染色,*浸泡約30min。
10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把已染色的凝膠
放在上面。關(guān)上樣品室外門(mén),打開(kāi)紫外燈(360nm或254nm),通過(guò)觀(guān)察孔進(jìn)行觀(guān)察。
注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質(zhì),務(wù)必小心,勿沾染于衣物、
皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專(zhuān)門(mén)的電泳區域操作,戴一次性手套,并及時(shí)更換。
2、預先加入EB時(shí)可能使DNA的泳動(dòng)速度下降15%左右,而且對不同構型的DNA的影
響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結果可以在電泳結束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸
泡染色。若膠內或樣品內已加EB,染色步驟可省略;若凝膠放置一段時(shí)間后才觀(guān)察,即使
原來(lái)膠內或樣品已加EB,也建議增加此步。
3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時(shí)清除,否則,需重新制膠。
4、以 0.5×TBE作為電泳緩沖液時(shí),溴酚蘭在0.5%~1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大約
相當于300bp的線(xiàn)性DNA的泳動(dòng)速度,而二甲苯青FF的泳動(dòng)速度相當于4Kb的雙鏈線(xiàn)
形DNA的泳動(dòng)速度。
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