Southern Blot 原理及實(shí)驗方法

原理： 將待檢測的 DNA 分子用/不用限制性?xún)惹忻赶?，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離， 繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素 或其它標記物標記的 DNA 或 RNA 探針進(jìn)行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列， 則二者通過(guò)堿基互補的原理進(jìn)行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢 測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。   用途：檢測樣品中的 DNA 及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴增重排等。  

試劑和器材

一、試劑

變性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 檸檬酸鈉。

以上溶液均在 100Kpa 滅菌 20 分鐘。

2×SSC：用無(wú)菌移液管吸取 20×SSC 溶液 5mL，加無(wú)菌水 45mL。

6×SSC：用無(wú)菌移液管吸取 20×SSC 溶液 15mL，加無(wú)菌水 75mL。

二、器材

22cm×15cm 瓷盤(pán)

操作方法

1. 在瓊脂糖凝膠上電泳分離 DNA。取出凝膠，切去邊緣多于部分，EB 染色，

在紫外燈下照相（放一標尺，可從像片中讀出 DNA 遷移的距離）。

2. 將凝膠置于 200mL 變性液中，浸泡 45 分鐘，并溫和地不斷振蕩，使凝膠上

的 ds-DNA 轉變?yōu)?/span> ss-DNA，然后用重蒸水沖洗凝膠幾次。

3. 用中和液浸泡凝膠并不斷地振蕩 45 分鐘，將凝膠中和至中性。防止凝膠的堿

性破壞硝酸纖維膜。

4. 取一個(gè)瓷盤(pán)，在底部放一塊玻璃板（或一塊海綿）使盛器內的 20 倍 SSC 轉移

濾液低于玻板表面，在玻板表面蓋一張 3mm 的二號濾紙，濾紙兩邊浸沒(méi)于 20

倍 SSC 溶液中，在玻璃和濾紙之間，趕掉所有的氣泡。

5. 把凝膠底面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間出現的氣泡。

6. 裁剪一張硝酸纖維膜，其長(cháng)與寬大于凝膠 1—2mm，并在角上作記號，以確定

濾膜方位。先把它放在去離子水中潤濕后，再放在 20 倍 SSC 溶液中潤濕 5 分鐘，

然后放在凝膠表面，兩層之間不可有氣泡。

7. 然后再把兩張與濾膜一樣大小的二號濾紙，在 2 倍 SSC 溶液中浸濕，覆蓋在

硝酸纖維膜上，同樣要把氣泡趕走。

8. 把一疊吸水紙（或衛生紙，約有 5—8cm 高，略小于濾紙），放置在濾紙上，

在吸水紙上再放一塊玻璃板和重約 500g 的重物，放置過(guò)夜。

9.轉移結束后，移去上面的吸水紙和濾紙，同時(shí)翻轉取出凝膠與硝酸纖維膜，把

凝膠的點(diǎn)樣與硝酸纖維膜的相對應位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標記。

11. 把已轉移了 DNA 的硝酸纖維膜放在 6 倍 SSC 溶液中振蕩浸泡 5 分鐘，然后

放在濾紙上吸干溶液。再把它夾在兩層濾紙之間，80℃真空干燥 2 小時(shí)。

注意事項

（1）將凝膠中和至中性時(shí)，要測 pH, 防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。

(2) 要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。

SDS-PAGE 實(shí)驗原理及注意事項 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)首先在 1967 年由 Shapiro 建立， 1969 年由 Weber 和 Osborn 進(jìn)一步完善。 一、原理       聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡(jiǎn)稱(chēng) Acr) 和交聯(lián)劑 N，N’—亞甲基雙丙 烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng) Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結構的凝膠， 并以此為支持物進(jìn)行電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據不同蛋白質(zhì)分子所帶電 荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區帶，如 果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應只分離出一 條區帶。SDS 是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定 的比例和蛋白質(zhì)分子結合成復合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過(guò)其本身原有 的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復合 物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長(cháng)的函數。 這種電泳方法稱(chēng)為 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱(chēng) SDS—PAGE）。由于 SDS-PAGE 可設法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度，因 此常用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含 有一種具三級結構的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結構的蛋白質(zhì)，那么 SDS—PAGE 后，就只出現一條蛋白質(zhì)區帶。SDS—PAGE 可分為圓盤(pán)狀和垂直板狀、 連續系統和不連續系統。本實(shí)驗采用垂直板狀不連續系統。所謂“不連續”是指 電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成。 1．樣品的濃縮效應    在不連續電泳系統中，含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠 緩沖液(Tris—HCl，pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris—HCl，pH8.8)，兩種凝膠的濃 度(即孔徑)也不相同。在這種條件下，緩沖系統中的 HCl 幾乎全部解離成 Cl－， 兩槽中的 Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解離成 Gly 的負離子，而酸性 蛋白質(zhì)也可解離出負離子。這些離子在電泳時(shí)都向正極移動(dòng)。C1—速度zui快(先 導離子)，其次為蛋白質(zhì)，Gly 負離子zui慢(尾隨離子)。由于 C1—很快超過(guò)蛋白 離子，因此在其后面形成一個(gè)電導較低、電位梯度較陡的區域，該區電位梯度zui 高，這是在電泳過(guò)程中形成的電位梯度的不連續性，導致蛋白質(zhì)和 Gly 離子加 快移動(dòng)，結果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利 于提高電泳的分辨率。 2．分子篩效應    蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后，條件有很大變化。由于其 pH 升高(電泳進(jìn)行時(shí) 常超過(guò) 9.0)，使 Gly 解 離成負離子的效應增加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)受到影響，遷移 率急劇下降。此兩項 變化，使 Gly 的移動(dòng)超過(guò)蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復存在，蛋白質(zhì)便在一 個(gè)較均一的 pH 和電壓 梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動(dòng)。分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分 子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)， 通過(guò)時(shí)受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會(huì )由于這種分子篩的效 應，把不同大小的蛋 白質(zhì)相互分開(kāi)。 二、注意事項

1. SDS 與蛋白質(zhì)的結合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g 蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不 可以超標，否則 SDS 結合量不足。 2. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時(shí)，必須同時(shí)作標準曲 線(xiàn)。不能利用這次的標準曲線(xiàn)作為下次用。并且 SDS-PAGE 測定分子量有 10％誤 差，不可*信任。 3. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成 的，它們在巰基乙醇和 SDS 的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一 類(lèi)蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相 對分子量。 4. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y構異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)） 不能采用該法測相對分子量。 5. 如果該電泳中出現拖尾、染色帶的背景不清晰等現象，可能是 SDS 不純引起。

? 印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來(lái)檢測 樣品的一種方法。1975 年，Southern 建立了將 DNA 轉移到硝酸纖維素膜（NC 膜） 上，并利用 DNA－RNA 雜交檢測特定的 DNA 片段的方法，稱(chēng)為 Southern 印跡法。 而后人們用類(lèi)似的方法，對 RNA 和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對 RNA 的印跡分析稱(chēng)為 Northern 印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為 Western 印跡法，對雙 向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為 Eastern 印跡法 Western Blot 基本原理：在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體， 然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測

一般流程：

SDS-PAGE 原理：     SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水 性的長(cháng)碳鏈.當 SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì )以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺 基酸結合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數蛋 白質(zhì)和 SDS 的平均結合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結合固定 比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強負價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且

? 蛋白樣品的制備 ? SDS聚丙烯酰胺   凝膠電泳

?轉膜 ?封閉

?一抗雜交

?二抗雜交

?底物顯色

每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下 分子大小一項因素 Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析

***SDS-PAGE 電泳：

1、膠不平？凝膠漏液？

? 膠板洗刷干凈 ? 加入 APS 和 TEMED 的量要合適 ? 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 ? 溫度合適，受熱不均勻導致膠聚合不均勻 ? 兩塊玻璃板底部要對齊 2、條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？

? 凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩 ? 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過(guò)高會(huì )擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會(huì )影響電泳效果，應趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適 ***轉膜及抗體檢測：

1、凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉膜

緩沖液過(guò)熱？ 

? 可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩沖液中浸泡 5-10min ? 電轉儀長(cháng)期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上 少許普通的草紙 ? 確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉膜過(guò)程注意降溫 ***背景太高 原因： 1、 膜沒(méi)有均勻浸濕         2、膜或者緩沖液污染 3、 封閉不充分             4、抗體與封閉劑出現交叉反應 5、 抗體濃度過(guò)高 對策： 1. 轉膜前用 100%甲醇將膜*浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉膜緩沖液 3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應 4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度