cDNA文庫構建 

(字體說(shuō)明：FANG-仿，DI-第,suan-酸 )

cDNA文庫

[原理]：

cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來(lái)源的DNA。CDNA

組成特點(diǎn)是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時(shí)應是先從獲得mRNA

開(kāi)始，在此基礎上，通過(guò)反轉錄酶作用產(chǎn)生一條與 mRNA 相互補的 DNA 鏈，然后除掉

mRNA，以DI一條DNA鏈為模板復制出DI二條DNA鏈（雙鏈）；再進(jìn)一步把此雙鏈插入

原核或真核載體。

      cDNA文庫的構建

分為六個(gè)階段：

階段1：反轉錄酶催化合成cDNADI一鏈

階段2：cDNADI二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接

[階段1：反轉錄酶催化合成cDNADI一鏈]

1．在置于冰上的無(wú)菌微量離心管內混合下列試劑進(jìn)行cDNADI一鏈的合成：

poly(A)+RNA (1μg/μl)                         10μl

寡核苷suan引物(1μg/μl)                          1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃)                    2.5μl

1mol/L KCl                                    3.5μl

250 mmol/L MgCl2                               2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L）        10μl

0.1 mol/L DTT                                   2μl

RNase抑制劑（選用）                          25單位

加H2O至                                      48μl

2．當所有反應組在 0℃混合后，取出 2.5μl 反應液轉移到另一個(gè) 0.5ml 微量離心管內。在

這個(gè)小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h。

4．溫育接近結束時(shí)，在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后將

反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然后轉移至冰上。

5．參考《分子克隆實(shí)驗指南》DI三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性

總活度和可被三氯乙suan（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的 DNA 分子質(zhì)量參

照物通過(guò)堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。

6．按下述方法計算cDNADI一鏈的合成量（推算方法略）：

    [摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的 cDNADI一鏈(μg)

7．盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。

[階段2：cDNADI二鏈的合成]

1．將下列試劑直接加入大規模DI一鏈反應混合物中：

10 mmol/L MgCl2                                70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4)                           5μl

10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）            10μl

1 mol/L (NH4)2SO4                               1.5μl

RNase H (1000單位/ml)                            1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml)            4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。

2．溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中：

β-NAD (50 mmol/L)                               1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)            1μl

室溫溫育15min。

3．溫育結束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合

物室溫溫育15分鐘。

4．取出3μl反應物，按步驟7和8描述的方法測定DI二鏈DNA的質(zhì)量。

5．將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中，用酚：氯FANG和氯FANG分別抽提混合

物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)乙suan鈉存在下，通過(guò)乙醇沉淀回收 DNA，將 DNA 溶解

在90μl TE(pH7.6)溶液中。

6．將下列試劑加到DNA溶液中：

10×T4多核苷suan激酶緩沖液                10μl

T4多核苷suan激酶（3000單位/ml）            1μl

室溫溫育15分鐘。

7．測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度，并按分子克隆實(shí)驗指南》DI三版附

錄8所述方法測定1μlDI二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙suan沉淀的放射性活度。

8．用下面公式計算DI二鏈反應中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNADI一鏈種的

dNTP的量。

[DI二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA DI二鏈合

成量/μg

x表示cDNADI一鏈量。CDNADI二鏈合成量通常為DI一鏈量的70~80%

9．用等量酚：氯FANG對含有磷suan化cDNA（來(lái)自步驟6）的反應物進(jìn)行抽提。

10．  Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進(jìn)行平衡，然后通過(guò)離

子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開(kāi)。

11．  加入0.1倍體積的3mol/L乙suan鈉（pH5.2）和 2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下

來(lái)的 cDNA，將樣品置于冰上至少 15 分鐘，然后在微量離心機上以高速度 4℃離心

15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來(lái)。

12．  用70%乙醇洗滌沉淀物，重復離心。

13．  小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。

14．  如果需要用

Eco R I甲基化酶對cDNA進(jìn)行甲基化，可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)

溶液中。另外，如果要將cDNA直接與

Not I或

Sal I接頭或寡核苷suan銜接子相連，可

將cDNA懸浮在 29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進(jìn)行cDNA合

成的下一步驟。

[階段3：cDNA的甲基化]

1．在cDNA樣品中加入以下試劑：

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)                      5μl

5 mol/L NaCl                                2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                       2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨suan                    1μl

加H2O至                                  96μl

2．取出兩小份樣品（各2μl）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。

3．在余下的反應混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶（80 000單位/ml），保存在0℃直至

步驟4完成。

4．再從大體積的反應液中吸出另外兩小分樣品（各 2μl）至 0.5ml 微量離心管中，分別編

為3號和4號。

5．在所有四小份樣品（來(lái)自步驟2和步驟4）加入100 ng質(zhì)粒DNA或500 ng的λ噬菌

體DNA。這些未甲基化的DNA在預實(shí)驗中用作底物以測定甲基化效率。

6．所有四份小樣實(shí)驗反應和大體積的反應均在37℃溫育1h。

7．于68℃加熱15min，用酚：氯FANG抽提大體積反應液一次，再用氯FANG抽提一次。

8．在大體積反應液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙suan鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混

勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應結果。

9．按下述方法分析4個(gè)小樣對照反應：

a.     在每一對照反應中分別加入：

0.1 mol/L MgCl2                      2μl

10× Eco R I 緩沖液                    2μl

加H2O至                           20μl

b.     在2號和4號反應管中分別加入20單位

Eco R I。

c.     四個(gè)對照樣品于37℃溫育1h，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

10．  微量離心機以高速離心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。棄上清，加入200μl 70%

乙醇洗滌沉淀，重復離心。

11．  用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾

干沉淀，然后將DNA溶于29μl TE（pH8.0）。

12．  盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一階段。

 [階段4：接頭或銜接子的連接]

cDNA末端的削平

1．cDNA樣品于68℃加熱5 min。

2．將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑：

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液    10μl

dNTP溶液，每種5 mmol/L               5μl

加H2O至                             50μl

3．加入1~2單位T4 噬菌體 DNA聚合酶（500單位/ml），37℃溫育15min。

4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以終止反應。

5．用酚：氯FANG抽提，再通過(guò)Sephadex G-50離心柱層析，除去未摻入的dNTP。

6．在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙suan鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于

4℃至少放置15 min。

7．在微量離心機上以高速離心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。沉淀經(jīng)空氣干燥后

溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

接頭-銜接子與cDNA的連接

8．將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液       2μl

800~1000 ng的磷suan化接頭或銜接子          2μl

T4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml）  1μl

10 mmol/L ATP                             2μl

混勻后，在16℃溫育 8~12h。

9．從反應液中吸出0.5μl貯存于4℃，其余反應液于68℃加熱15min以滅活連接酶。

[階段5：Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制備

1．用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進(jìn)1ml滅菌吸管端部，用無(wú)菌剪刀剪去露在

吸管外的棉花并棄去，再用濾過(guò)的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

2．將一段無(wú)菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的

TE（pH7.6）溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸，直至吸

管內充滿(mǎn)緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。

3．在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數分鐘，放開(kāi)止血鉗，當緩沖液從吸管滴

落時(shí)，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的 Sepharose CL-4B，直至填充基

質(zhì)幾乎充滿(mǎn)吸管為止。

4．將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子

底部的軟管。

依據大小分離回收DNA

5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體，將cDNA加到柱上（體積50μl

或更?。?，放開(kāi)止血鉗，使cDNA進(jìn)入凝膠。用50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微

量離心管，將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿(mǎn)泡沫管。

6．用手提式小型探測器監測 cDNA 流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性 cDNA 流到柱長(cháng) 2/3 時(shí)，開(kāi)

始用微量離心管收集，每管2滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。

7．用切侖科夫計數器測量每管的放射性活性。

8．從每一管中取出一小份，以末端標記的已知大?。?/span>0.2kb~5kb）的 DNA 片斷作標準參

照物，通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析，將各管余下部分貯存于-20℃，直至獲得瓊脂糖

凝膠電泳的放射自顯影片。

9．電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張Saran包裝膜，并在凝膠干

燥器上干燥。干燥過(guò)程前 20min 至 30min 于 50℃加熱凝膠，然后停止加熱，在真空

狀態(tài)繼續干燥1~2h.

10．  置-70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線(xiàn)曝光。

11．  在cDNA長(cháng)度≥500bp的收集管中，加入0.1倍體積的3mol/L乙suan鈉（pH5.2）和

二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機于4℃以12 000g

離心15min，以回收沉淀的cDNA。

12．  將DNA溶于總體積為20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13．  測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于

λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到DI二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNADI二鏈合成量

=可用于連接的cDNA

[階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接]

1．按下述方法建立4組連接-包裝反應：

連接 A(μl) B(μl) C(μl) D(μl)

λ噬菌體DNA(0.5μg/μl) 1.0 1.0 1.0 1.0

10×T4DNA連接酶緩沖液 1.0 1.0 1.0 1.0

cDNA 0 ng 5 ng 10 ng 50 ng

T4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 0.1 0.1 0.1 0.1

10 mmol/L ATP 1.0 1.0 1.0 1.0

加H2O至 10 10 10 10

連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

2．按包裝提取物廠(chǎng)商提供的方法，從每組連接反應物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

3．包裝反應完成后，在各反應混合物中加入0.5ml SM培養基。

4．預備適當的大腸桿菌株新鮮過(guò)夜培養物，包裝混合物做 100 倍稀釋?zhuān)魅?/span>10μl 和100

μl涂板，于37℃或42℃培養8~12小時(shí)。

5．計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑，連接反應 A 不應產(chǎn)生重組噬菌斑，而連接反應 B、C

和D應產(chǎn)生數目遞增的重組噬菌斑。

6．根據重組噬菌斑的數目，計算cDNA的克隆效率。

7．挑取 12 個(gè)重組λ噬菌體空斑，小規模培養裂解物并制備 DNA，以供適當的限制性?xún)惹?/span>

核suan酶消化。

8．通過(guò) 1%瓊脂凝膠電泳分析 cDNA 插入物的大小，用長(cháng)度范圍500bp~5