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降落PCR
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降落 PCR(touchdown PCR),一種 PCR 技術(shù),主要用于 PCR 的條件的優(yōu)化。在許多情
況下引物的設計使得PCR難以進(jìn)行,例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過(guò)高會(huì )使PCR效
率過(guò)低,但退火溫度過(guò)低則會(huì )使非特異擴增過(guò)多。
實(shí)驗材料:
基因樣品
儀器、耗材:
PCR儀
實(shí)驗步驟:
1. 反應體積為50 μl。
2. 人CD137胞膜外區基因的PCR擴增體系:CD137-pCDNA3質(zhì)粒4 μl,P1,P2各0.5
μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
3. hIgG1Fc片段的PCR擴增體系:含人hIgG1Fc的PGEM-T質(zhì)粒4 μl,P3、P4 各0.4
μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
4. HBVDNA多聚酶基因的PCR擴增體系:
(1)Di一輪:HBVDNA模板4 μl,P5、P6各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP
0.2 mmol/L,Taq 0.8 U.
(2)第二輪:取5倍稀釋的Di一輪PCR產(chǎn)物4μl為模板,P7、P8各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5
mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U。
5. 分別在各滅菌PCR管加入上述各反應成分,100℃煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入
TaqDNA聚合酶,混勻,離心,PCR程序如下:
6. 取 10 μl PCR 擴增產(chǎn)物,在2%或3%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀(guān)察擴增產(chǎn)物。
注意事項:
由于目標是在較早的循環(huán)中避免低Tm 值配對,在TD—PCR中應用熱啟動(dòng)技術(shù)。設計
時(shí),退火溫度的范圍應跨越15℃左右,從高于估計Tm 值至少幾度到低于它10℃
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