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普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟
普通PCR
1概述 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱(chēng) PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù), 用于放大特定的 DNA 片段??煽醋魃矬w外的特殊 DNA 復制。DNA 聚合酶(DNA polymerase I)早于1955年發(fā)現,而較具有實(shí)驗價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現,但由于此酶不耐高溫,高溫能使 之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應?,F今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng) Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細菌(Thermus aquaticus)分離出來(lái)的。它的 特性就在于能耐高溫,是一個(gè)很理想的酶,但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR初期的 原始雛形概念是類(lèi)似基因修復復制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了一個(gè)單純且短暫性基因復制(類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應)的實(shí)驗。而現今所發(fā)展出來(lái)的PCR 則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的,Dr. Mullis當年服務(wù)于PE公司,因此PE公司 在 PCR 界有著(zhù)特殊的地位。Dr. Mullis 并于 1985 年與 Saiki 等人正式發(fā)表了一篇相關(guān) 的論文。此后,PCR 的運用一日千里,相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法 難望其項背。隨后 PCR 技術(shù)在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用,成為分子生物學(xué)研究 的重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。 2 PCR原理 PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程,其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補 的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成:①模板DNA的變性: 模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA 解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火 (復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互 補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以 dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模 板DNA 鏈互補的半保留復制鏈,重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保 留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3 小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。 3 PCR反應體系與反應條件 3.1標準的PCR反應體系 10×擴增緩沖液 10μl 4種dNTP混合物 200μl 引物 10~100μl 模板DNA 0.1~2μg
Taq DNA聚合酶 2.5 μl Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水 100 μl
3.2 PCR反應五要素 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為 DNA的片段,細胞內DNA復制的 引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)。[ PCR步驟] 標準的PCR過(guò)程分為三步: 1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA 2.退火(25℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。 3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性佳)的作用下,以dNTP為原 料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。 每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍?,F在有些PCR因為擴增區很 短,即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時(shí)間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退 火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行,以減少一次升降溫過(guò)程,提高了反應速度。 4 PCR反應特點(diǎn) 4.1特異性強 PCR反應的特異性決定因素為: ①引物與模板DNA特異正確的結合; ②堿基配對原則; ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實(shí)性; ④靶基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結合是關(guān)鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對 原則的。聚合酶合成反應的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結 合(復性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保 持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。 4.2 靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴 增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細胞中檢出一個(gè)靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的 靈敏度可達3個(gè)RFU(空斑形成單位);在細菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細菌。 4.3簡(jiǎn)便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液 和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時(shí)完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電 泳分析,不一定要用同位素,無(wú)放射性污染、易推廣。 4.4 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板??芍苯?/span> 用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。 5 PCR常見(jiàn)問(wèn)題 5.1假陰性,不出現擴增條帶
PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及, ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。 模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化 除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,或吸入酚。⑤模 板核酸 變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核 酸提取過(guò)程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應 固定不宜隨意更 改。 酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導 致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng),是PCR失敗或擴增條帶不 理 想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度 高,一條 濃度低,造成低效率的不對稱(chēng)擴增,對策為:①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃 度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且 兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失 敗,應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其 濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分,導致引物變質(zhì) 降解失效。④引物設計不合理,如引物長(cháng)度不夠,引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過(guò)高可降低PCR擴增的 特 異性,濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 反應體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?;?/span> 100ul,應 用多 大體積進(jìn)行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。 物理原因:變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出 現假陰性;退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物 與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水 溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某 段 缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會(huì )成功的。 5.2 假陽(yáng)性 出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。 引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴增 時(shí),擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽(yáng)性。需 重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉 污染,導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:操作時(shí)應小心輕柔,防止將靶序列吸入 加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所 用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。必要時(shí),在加標本前,反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射, 以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同
源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補后,可擴增出PCR產(chǎn)物,而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式 PCR方法來(lái)減輕或消除。 5.3 出現非特異性擴增帶 PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不*互補、 或引 物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有 關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現, 酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有:必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換 另一來(lái)源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用 二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。 5.4出現片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有:減 少酶量,或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量, 減少循環(huán)次數。
原位PCR 在科學(xué)研究中,每一項新技術(shù)的創(chuàng )立都會(huì )帶來(lái)一系列新的研究成果問(wèn)世,從而推動(dòng)著(zhù)各 學(xué)科的發(fā)展??v觀(guān)形態(tài)研究領(lǐng)域,50 年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀(guān)察領(lǐng)域,帶來(lái)了從細胞 水平到亞細胞水平的深入研究;60-70年代,免疫組織化學(xué)與免疫細胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應用, 又將觀(guān)察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質(zhì)分子水平,使細胞內眾多的活性物質(zhì)得以進(jìn)行細 胞或亞細胞水平的定位,對醫學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無(wú)疑產(chǎn)生了深刻的影響。70 年代,分子生物 學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應用,隨著(zhù)原位雜交技術(shù)的出現,使組織細胞內特定的 DNA 或 RNA 序列能夠被定位,將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀(guān)察和定位,從而使 人類(lèi)對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化;80 年代,分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項具有 強大生命力的技術(shù)PCR——多聚酶鏈反應技術(shù)問(wèn)世了,很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀(guān)察的領(lǐng)域, 使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA 或 RNA 得以進(jìn)行定位及觀(guān)察。這一技術(shù)的問(wèn)世,必 將帶來(lái)更多的研究成果,使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。 1基本原理 原位PCR技術(shù)的基本原理,就是將PCR技術(shù)的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起 來(lái),從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下,經(jīng)過(guò)模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán),將引物 引導下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴增,經(jīng)過(guò)擴增的靶序列(一般能擴增106倍),很容易 在凝膠電泳或 Southern 印記雜交中顯示出來(lái),因此,PCR 技術(shù)具有靈敏度高,特異性強 的優(yōu)勢,隨著(zhù)熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩定也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。但是,PCR技 術(shù)是在液相中進(jìn)行的,在擴增前,需將細胞破壞,從中提取核酸作為模板,因此很難將PCR 的結果與組織細胞的形態(tài)結構聯(lián)系起來(lái),同時(shí),也很難判斷含特異性靶序列的細胞類(lèi)型。 原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結合起來(lái),保持了兩項技術(shù)的優(yōu)勢又
彌補了各自的不足。原位 PCR 技術(shù)的待檢標本一般先經(jīng)化學(xué)固定,以保持組織細胞的良好 形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性,當進(jìn)行 PCR 擴增時(shí),各種成分,如引物, DNA 聚合酶,核苷酸等均可進(jìn)入細胞內或細胞核內,以固定在細胞內或細胞核內的 RNA 或DNA為模板,于原位進(jìn)行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大,或互相交織,不易穿過(guò)細胞 膜或在膜內外彌散,從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或 RNA序列在原位以呈指數極擴增,擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 2 基本類(lèi)型 根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記,原位PCR技術(shù)可分為直接 法和間接法兩大類(lèi),此外,還有反轉錄原位PCR技術(shù)等。 2.1直接法原位PCR技術(shù) 直接法原位PCR技術(shù)是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子,即使用標記的三磷酸腺苷或 引物片斷。當標本進(jìn)行PCR擴增時(shí),標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中,顯示標記物,就 能將特定的DNA或RNA在標本(原位)中顯現出來(lái)。 常用的標記物有放射性同位素35S,生物素和地高xin,用放射性自顯影的方法或用親和組織 化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標記物所在位置。 直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,流程短,省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差,易出現 假陽(yáng)性,擴增效率也較低,特別是在石蠟切片上,上述缺點(diǎn)更為突出。因為在制片過(guò)程中, 無(wú)論是固定,脫水還是包埋,都會(huì )導致DNA的損害,而受損的DNA可利用反應體系中的 標記三磷酸核苷進(jìn)行修復,這樣標記物就會(huì )摻入到DNA的非靶序列中,造成假陽(yáng)性。若用 標記引物的方法進(jìn)行直接法原位PCR,其擴增的效率比不標記更低。 2.2 間接法原位PCR技術(shù) 間接法原位PCR技術(shù)師現在細胞內進(jìn)行特定DNA或RNA擴增,再用標記的探針進(jìn)行 原位雜交,明顯提高了特異性,是目前應用為廣泛的原位PCR技術(shù)。 間接法原位PCR與直接法不同的是,反應體系與常規PCR相同,所用的引物或三磷酸腺苷 均不帶任何標記物。即實(shí)現先擴增的目的,然后用原位雜交技術(shù)去檢測細胞內已擴增的特定 的DNA產(chǎn)物,因此,實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結合起來(lái)的一種新技術(shù),故又 稱(chēng)之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高,擴增效率也較高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。 2.3 原位反轉錄PCR技術(shù) 原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR 技術(shù)應用到組織細胞標本中的一種新技術(shù),與RT-PCR(液相)不同點(diǎn)在于,進(jìn)行原位反轉 錄PCR反應之前,組織標本要先用DNA酶處理,以破壞組織中的DNA酶,這樣才能保證 擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA,而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟 與液相的RT-PCR相似。 3 基本步驟 原位PCR技術(shù)的基本步驟包括標本的制備。原位擴增(PCR)及原位檢測等基本環(huán)節, 現分述如下(重點(diǎn)以石蠟切片為例)。 3.1 標本的制備
原位PCR技術(shù)可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言,以懸 浮的完整細胞做原位PCR效果好,石蠟切片效果差。隨著(zhù)技術(shù)方面的一些問(wèn)題被解決, 近年也有從石蠟切片中得到滿(mǎn)意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的,如:玻 片上做PCR,熱傳導較差,熱對流不均勻,TaqDNA酶被玻璃片吸附等,更為主要的原因, 可能是標本經(jīng)制片后,細胞缺乏完整的胞漿或核膜,擴增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導致擴增的產(chǎn)物 在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定,石蠟包埋的形式保存的,若能 很好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題,意義顯然是十分重大的。 組織細胞的固定 一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn) 行原位PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過(guò)長(cháng),視組織的大小,一般以4℃4-6小時(shí)為 宜。 切片的厚度 一般而言,切片若厚一些,原位PCR的效果也較好一些,因為切片越厚, 靶DNA的含量也就越多,同時(shí)膜結構也較多,防止擴增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切 片細胞重疊多,形態(tài)學(xué)觀(guān)察的效果就差了,分辨率也將下降。 玻片的處理 為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過(guò)程中脫落,在玻片應作防脫片處理, 常用的方法是涂以多聚賴(lài)氨酸或用硅烷化處理,一般能防止組織脫落。 蛋白酶的消化作用 在進(jìn)行原位擴增之前,組織標本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織 細胞,可增加其通透性,充分允許反應體系中的各成分進(jìn)入細胞內,并能很好的暴露靶序列, 以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據 組織固定的程度進(jìn)行調整。蛋白酶消化后,要注意加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將 酶*去除,因為只要有少量的殘留酶存在,都將對隨后進(jìn)行的PCR反應體系的數量 TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。 蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性,有利于后續進(jìn)行的各反應成分進(jìn)入細胞內或核內, 但同時(shí)也使得擴增產(chǎn)物的彌散機會(huì )增多,有可能帶來(lái)假陽(yáng)性或假陰性的結果。 原位擴增(PCR) 原位擴增即在組織細胞標本上進(jìn)行PCR反應,其基本原理與液相PCR*相同。 引物 PCR所用的引物一般為15-30bp為宜,擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR 宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過(guò)400bp,RNA很少超過(guò)200bp,較 長(cháng)序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。 反應體系 原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同,由于是在經(jīng)過(guò)固定的組 織切片上進(jìn)行,為獲得較好的擴增效果,有人主張反應體系中的引物,TaqDNA聚合酶以 及Mg2+的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白(BSA) , 以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。 熱循環(huán) 原位PCR的熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行,操作簡(jiǎn)便。也可在一般的PCR 熱循環(huán)儀上進(jìn)行,通常在樣品臺上覆蓋一層鋁箔,制成平臺,樣品臺上的空間用礦物油或水 充填,將載玻片至于平臺上,即可進(jìn)行熱循環(huán)的步驟。 為了保證進(jìn)行充分的擴增,原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規PCR略長(cháng)些,另外, 也可采用熱啟動(dòng)(hot start)的方法,即玻片加熱到80-94℃時(shí),再立即加入TaqDNA聚 合酶。
為了保證反應體系在熱循環(huán)過(guò)程不過(guò)多丟失,可用清亮的指甲油,礦物油或PAP筆把蓋片 四周封閉起來(lái)。 洗滌 原位擴增結束后,標本應清洗,以除去彌散到細胞外的擴增產(chǎn)物。洗滌不充分, 會(huì )導致擴增產(chǎn)物在檢測時(shí)顯現,造成背景過(guò)深或假陽(yáng)性結果的出現。但是,洗滌過(guò)度,也會(huì ) 造成細胞內擴增的產(chǎn)物被洗脫,是陽(yáng)性信號減弱或丟失。 有作者在擴增后用4%多聚甲醛2小時(shí)或2%戊二醛 5分鐘進(jìn)行后固定,以使擴增的產(chǎn)物在 檢測時(shí)能很好地保留在細胞內,提高檢測的敏感性和特異性。 原位檢測 原位PCR的擴增產(chǎn)物檢測方法,取決于原位PCR的設計方案,直接法則根 據標記分子的性質(zhì)對擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)行檢測。 4 原位PCR技術(shù)的應用 原位PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢,就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序 列。按照待測基因的性質(zhì),可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。 4.1用于外源性基因的檢測 4.1.1病毒基因的檢測 感染病毒的細胞常無(wú)較好的檢測手段,但當原位PCR技術(shù)應用后,使這一極為困難的 問(wèn)題有望解決。 對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測,使我們能夠成功等觀(guān)察到這些病毒 在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用,能夠及時(shí)發(fā)現受感染的人群。 4.1.2細菌基因的檢測 突出的應用是在結核桿菌的檢測上,當結核病變不夠典型時(shí),經(jīng)過(guò)特殊染色的方法很 難在鏡下找到結核桿菌,而應用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷,當結核桿菌很少時(shí)仍能在 鏡下被很容易地找出來(lái)。 4.1.3導入基因的檢測 在轉基因動(dòng)物的研究中,是否導入了基因,在接受基因治療的患者體內,是否接受了導 入的基因,均可用原位PCR技術(shù)來(lái)證實(shí)。因此,原位PCR技術(shù)成為重要的檢測手段。 4.2 用于內源性基因的檢測 4.2.1異?;虻臋z測 機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進(jìn)行檢測,原癌基因,抑癌基因的突 變,惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排,對腫瘤的研究和診斷無(wú)一均提供了廣闊的應用 前景。 4.2.2固有基因的檢測 對于機體細胞內只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達固有基因,原位雜交技術(shù)因基因拷貝數太 少而無(wú)能為力,液相PCR雖可進(jìn)行擴增檢測出來(lái),但不能確定含有該基因的細胞類(lèi)型,原 位PCR技術(shù)則彌補了上述兩種技術(shù)的不足,使得我們能夠對人類(lèi)各種基因進(jìn)行檢測,而完 成人類(lèi)基因圖的繪制。
反向PCR
反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來(lái)擴增兩引物以外的未知序列的片段,而 常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA的片段.實(shí)驗時(shí)選擇已知序列內部沒(méi)有切點(diǎn)的 限制性?xún)惹忻笇υ摱?/span>DNA進(jìn)行酶切,然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接,再 用一對反向的引物進(jìn)行PCR,其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列,從而對未知序進(jìn)行分 析研究. 反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA,也就是說(shuō)這一反應體系不是在一 對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未 知染色體序列,因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA 區兩末端序列互補,但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性?xún)惹忻该盖袠悠?/span> DNA,然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子,通過(guò)反向PCR擴增引物的上游片 段和下游片段;現已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線(xiàn)狀DNA的片段的雜交探針,這對 于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA的片段序列的識別十分重要。 PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段,反向PCR可擴增中間一段已知序列,而兩端 序列未知的基因片段不擴增。 反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA,也就是說(shuō)這一反應體系不是 在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接 的未知染色體序列,因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心 DNA區兩末端序列互補,但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性?xún)惹忻该盖袠?/span> 品DNA,然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子,通過(guò)反向PCR擴增引物的上游 片段和下游片段;現已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線(xiàn)狀DNA的片段的雜交探針,這 對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA的片段段序列的識別十分重要。 該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶,或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn) 行酶切才能得到合理大小的DNA的片段段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多 數有核基因組含有大量中度和高度重復序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有 時(shí)也會(huì )有這些序列,這樣,通過(guò)反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。 利用反向PCR可對未知序列擴增后進(jìn)行分析,探索鄰接已知DNA的片段的序列, 并可將僅知部分序列的全長(cháng)cDNA進(jìn)行分子克隆,建立全長(cháng)的DNA探針。適用于基因游 走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點(diǎn)分析等研究。 用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大 小由 PCR擴增片段的大小決定,目前,PCR擴增的實(shí)際上限為3-4kb。在許多情況下,首 先 需要進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定內切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴(lài)于引物)的上游 或上 游區,而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增,并帶有由內切酶和環(huán)化類(lèi) 型決定的 接點(diǎn)(例如,互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列,初試時(shí) 好靠近識別 上個(gè)堿基位位的酶,并已知在核心區有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向 PCR從含有大量不 同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針,建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。 用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗中,為產(chǎn)生對反 向 PCR大小適當的DNA的片段段需要兩種內切酶,但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接,
環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前,需用酚或熱變性使內 切 酶失活。 聚合酶鏈反應條件與經(jīng)典所用的相同,例如,94℃-30秒變性,58℃-30秒引物 退火, Taq聚合酶70℃延伸3分鐘,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)??筛淖?/span>PCR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。 將反向 PCR用于測序時(shí),與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用,它使測序引物擴增 部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點(diǎn)更近,減少了擴增引物的干擾。 描述一種大聚合酶鏈反應應用的方法,使在已知序列的核心區邊側的未知 成幾何級數 擴增 用適當的限制性?xún)惹辛呀夂诵膮^的,以產(chǎn)生適合于擴 增大小的片段,然后片段的 末端再連接形成環(huán)狀分子 的引物同源于環(huán)上核心區 的末端序列,但其方向性,使鏈的延 長(cháng)經(jīng)過(guò)環(huán)上的未知區而不是分開(kāi)引物的核心區 這種反向方法可用于擴增本來(lái)就在核心區 旁邊的序列,還可應用于制備未知序列 探針或測定邊側區域本身的上 下游序列
逆轉錄PCR
1概念 RT-PCR 為反轉錄RCR(reverse transcription PCR)和實(shí)時(shí)PCR(real time PCR) 共同的縮寫(xiě)。 逆轉錄PCR,或者稱(chēng)反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈 式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA, 再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴增。 由一條 RNA 單鏈轉錄為互補 DNA(cDNA)稱(chēng)作“逆轉錄”,由依賴(lài) RNA 的 DNA 聚 合酶(逆轉錄酶)來(lái)完成。隨后,DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴(lài)DNA的DNA 聚合酶完成,隨每個(gè)循環(huán)倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下 互補DNA。 RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術(shù),可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛 應用于遺傳病的診斷,并且可以用于定量監測某種 RNA 的含量。(檢測基因表達的方法, 參見(jiàn)Northern Blot法。) RT-PCR有時(shí)候也會(huì )指代實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)。為了與逆轉錄PCR相區別,通常 被寫(xiě)作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 時(shí)實(shí) PCR,屬于定量 PCR(Q-PCR)的一種,以一定時(shí)間內 DNA 的增幅量為基礎進(jìn) 行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用螢光色素,目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特 異的螢光色素;另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種螢光探 針(probe)。 real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合,能用微量的RNA來(lái)找出特定 時(shí)間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種 RT PCR 的組合又被稱(chēng)之為“定量 RT-PCR(quantitative RT-PCR)” 2 PCR各步驟的目的
2.1預變性: 破壞 DNA 中可能存在的較難破壞的二級結構。 使 DNA 充分變性,減少 DNA 復雜 結構對擴增的影響,以利于引物更好的和模板結合,特別是對于基因組來(lái)源的DNA模板,不要吝嗇這個(gè)步驟。此外,在一些使用熱啟動(dòng) Taq 酶的反應中,還可激活 Taq 酶,從 而使PCR反應得以順利進(jìn)行。 2.2變性--退火--延伸循環(huán): 2.2.1模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙 鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應 作準備; 2.2.2模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃ 左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合; 2.2.3 引物的延伸:DNA 模板--引物結合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 為 反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互 補的半保留復制鏈。 3用PCR儀擴增時(shí),(變性.退火,延伸)循環(huán)完成后,繼續 72度延伸了10分鐘的原因: 3.1.延伸時(shí)間取決于待擴增DNA的片段的長(cháng)度。(當然是在反應體系一定的條件下)例如, 使用taqDNA聚合酶,72度時(shí)的堿基摻入率為35-100bp/s,因此延伸速率為1kb/min。
3.2.根據延伸速率推得,擴增1kb以?xún)鹊?/span>DNA的片段1min即可,而3-4kb則需要3-4min, 依次照推。通常在zui后一輪要適當的將延伸時(shí)間延長(cháng)至 4-10min,這樣做是使 pcr 反應完 全以提高擴增產(chǎn)量。 3.3.繼續72度延伸了10分鐘除了可以使pcr反應*以提高擴增產(chǎn)量外,還有一個(gè)作 用是:在用普通 taq酶進(jìn)行 PCR擴增
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