普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟

普通PCR

1概述 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱(chēng) PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)， 用于放大特定的 DNA 片段?？煽醋魃矬w外的特殊 DNA 復制。DNA 聚合酶（DNA polymerase I）早于1955年發(fā)現，而較具有實(shí)驗價(jià)值及實(shí)用性的Klenow fragment of E. Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現，但由于此酶不耐高溫，高溫能使 之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應?，F今所使用的酶(簡(jiǎn)稱(chēng) Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)的。它的 特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR初期的 原始雛形概念是類(lèi)似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了一個(gè)單純且短暫性基因復制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應）的實(shí)驗。而現今所發(fā)展出來(lái)的PCR 則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務(wù)于PE公司，因此PE公司 在 PCR 界有著(zhù)特殊的地位。Dr. Mullis 并于 1985 年與 Saiki 等人正式發(fā)表了一篇相關(guān) 的論文。此后，PCR 的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)是令眾多其它研究方法 難望其項背。隨后 PCR 技術(shù)在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學(xué)研究 的重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。 2 PCR原理 PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補 的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應步驟構成：①模板DNA的變性： 模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火 (復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互 補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模 板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保 留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3 小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。 3 PCR反應體系與反應條件 3.1標準的PCR反應體系    10×擴增緩沖液 10μl     4種dNTP混合物 200μl     引物 10～100μl     模板DNA 0.1～2μg    

Taq DNA聚合酶 2.5 μl     Mg2+ 1.5mmol/L     加雙或三蒸水 100 μl    

3.2 PCR反應五要素 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為 DNA的片段，細胞內DNA復制的 引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。［ PCR步驟］   標準的PCR過(guò)程分為三步：   1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA   2.退火（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。   3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性佳）的作用下，以dNTP為原 料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。   每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F在有些PCR因為擴增區很 短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時(shí)間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退 火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應速度。  4 PCR反應特點(diǎn) 4.1特異性強   PCR反應的特異性決定因素為：   ①引物與模板DNA特異正確的結合；   ②堿基配對原則；   ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實(shí)性；   ④靶基因的特異性與保守性。   其中引物與模板的正確結合是關(guān)鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對 原則的。聚合酶合成反應的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結 合(復性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保 持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。 4.2 靈敏度高   PCR產(chǎn)物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴 增到微克(μg=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細胞中檢出一個(gè)靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的 靈敏度可達3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中zui小檢出率為3個(gè)細菌。 4.3簡(jiǎn)便、快速   PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液 和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時(shí)完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電 泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。 4.4 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯?/span> 用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。  5 PCR常見(jiàn)問(wèn)題  5.1假陰性，不出現擴增條帶

  PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。   模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化 除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸 變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核 酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更 改。   酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導 致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。   引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不 理 想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條 濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃 度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且 兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失 敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其 濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì) 降解失效。④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。   Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的 特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。   反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?/span> 100ul，應 用多 大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。   物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出 現假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物 與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水 溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。   靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段 缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。 5.2 假陽(yáng)性   出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。   引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增 時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。需 重新設計引物。   靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉 污染，導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入 加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所 用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射， 以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同

源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR方法來(lái)減輕或消除。 5.3 出現非特異性擴增帶   PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、 或引 物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有 關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現， 酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換 另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用 二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 5.4出現片狀拖帶或涂抹帶   PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：減 少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量， 減少循環(huán)次數。

原位PCR 在科學(xué)研究中，每一項新技術(shù)的創(chuàng )立都會(huì )帶來(lái)一系列新的研究成果問(wèn)世，從而推動(dòng)著(zhù)各 學(xué)科的發(fā)展?？v觀(guān)形態(tài)研究領(lǐng)域，50 年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀(guān)察領(lǐng)域，帶來(lái)了從細胞 水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學(xué)與免疫細胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應用， 又將觀(guān)察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細胞內眾多的活性物質(zhì)得以進(jìn)行細 胞或亞細胞水平的定位，對醫學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無(wú)疑產(chǎn)生了深刻的影響。70 年代，分子生物 學(xué)技術(shù)在形態(tài)學(xué)中的廣泛應用，隨著(zhù)原位雜交技術(shù)的出現，使組織細胞內特定的 DNA 或 RNA 序列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水平又提高到基因水平即核酸分子的觀(guān)察和定位，從而使 人類(lèi)對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化；80 年代，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項具有 強大生命力的技術(shù)PCR——多聚酶鏈反應技術(shù)問(wèn)世了，很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀(guān)察的領(lǐng)域， 使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA 或 RNA 得以進(jìn)行定位及觀(guān)察。這一技術(shù)的問(wèn)世，必 將帶來(lái)更多的研究成果，使形態(tài)學(xué)的研究又向前邁出一大步。   1基本原理      原位PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起 來(lái)，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。  PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過(guò)模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，將引物 引導下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴增，經(jīng)過(guò)擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易 在凝膠電泳或 Southern 印記雜交中顯示出來(lái)，因此，PCR 技術(shù)具有靈敏度高，特異性強 的優(yōu)勢，隨著(zhù)熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩定也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。但是，PCR技 術(shù)是在液相中進(jìn)行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR 的結果與組織細胞的形態(tài)結構聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類(lèi)型。      原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結合起來(lái)，保持了兩項技術(shù)的優(yōu)勢又

彌補了各自的不足。原位 PCR 技術(shù)的待檢標本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細胞的良好 形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進(jìn)行 PCR 擴增時(shí)，各種成分，如引物， DNA 聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的 RNA 或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細胞 膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或 RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。  2 基本類(lèi)型    根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術(shù)可分為直接 法和間接法兩大類(lèi)，此外，還有反轉錄原位PCR技術(shù)等。  2.1直接法原位PCR技術(shù)      直接法原位PCR技術(shù)是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或 引物片斷。當標本進(jìn)行PCR擴增時(shí)，標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中，顯示標記物，就 能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現出來(lái)。  常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高xin，用放射性自顯影的方法或用親和組織 化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標記物所在位置。  直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，流程短，省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差，易出現 假陽(yáng)性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。因為在制片過(guò)程中， 無(wú)論是固定，脫水還是包埋，都會(huì )導致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的 標記三磷酸核苷進(jìn)行修復，這樣標記物就會(huì )摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽(yáng)性。若用 標記引物的方法進(jìn)行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。  2.2 間接法原位PCR技術(shù)      間接法原位PCR技術(shù)師現在細胞內進(jìn)行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進(jìn)行 原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用為廣泛的原位PCR技術(shù)。  間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷 均不帶任何標記物。即實(shí)現先擴增的目的，然后用原位雜交技術(shù)去檢測細胞內已擴增的特定 的DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結合起來(lái)的一種新技術(shù)，故又 稱(chēng)之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。  間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴增效率也較高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。  2.3 原位反轉錄PCR技術(shù) 原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR 技術(shù)應用到組織細胞標本中的一種新技術(shù)，與RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉 錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證 擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟 與液相的RT-PCR相似。 3 基本步驟       原位PCR技術(shù)的基本步驟包括標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環(huán)節， 現分述如下（重點(diǎn)以石蠟切片為例）。  3.1 標本的制備 

原位PCR技術(shù)可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸 浮的完整細胞做原位PCR效果好，石蠟切片效果差。隨著(zhù)技術(shù)方面的一些問(wèn)題被解決， 近年也有從石蠟切片中得到滿(mǎn)意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻 片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因， 可能是標本經(jīng)制片后，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導致擴增的產(chǎn)物 在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能 很好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題，意義顯然是十分重大的。      組織細胞的固定  一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn) 行原位PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過(guò)長(cháng)，視組織的大小，一般以4℃4-6小時(shí)為 宜。      切片的厚度  一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚， 靶DNA的含量也就越多，同時(shí)膜結構也較多，防止擴增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切 片細胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀(guān)察的效果就差了，分辨率也將下降。      玻片的處理  為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過(guò)程中脫落，在玻片應作防脫片處理， 常用的方法是涂以多聚賴(lài)氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。  蛋白酶的消化作用  在進(jìn)行原位擴增之前，組織標本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織 細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進(jìn)入細胞內，并能很好的暴露靶序列， 以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據 組織固定的程度進(jìn)行調整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將 酶*去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進(jìn)行的PCR反應體系的數量 TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。  蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利于后續進(jìn)行的各反應成分進(jìn)入細胞內或核內， 但同時(shí)也使得擴增產(chǎn)物的彌散機會(huì )增多，有可能帶來(lái)假陽(yáng)性或假陰性的結果。      原位擴增（PCR）  原位擴增即在組織細胞標本上進(jìn)行PCR反應，其基本原理與液相PCR*相同。  引物  PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR 宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過(guò)400bp，RNA很少超過(guò)200bp，較 長(cháng)序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。  反應體系  原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由于是在經(jīng)過(guò)固定的組 織切片上進(jìn)行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以 及Mg2+的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA） , 以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。      熱循環(huán)  原位PCR的熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。也可在一般的PCR 熱循環(huán)儀上進(jìn)行，通常在樣品臺上覆蓋一層鋁箔，制成平臺，樣品臺上的空間用礦物油或水 充填，將載玻片至于平臺上，即可進(jìn)行熱循環(huán)的步驟。  為了保證進(jìn)行充分的擴增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規PCR略長(cháng)些，另外， 也可采用熱啟動(dòng)（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94℃時(shí)，再立即加入TaqDNA聚 合酶。 

為了保證反應體系在熱循環(huán)過(guò)程不過(guò)多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片 四周封閉起來(lái)。      洗滌  原位擴增結束后，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產(chǎn)物。洗滌不充分， 會(huì )導致擴增產(chǎn)物在檢測時(shí)顯現，造成背景過(guò)深或假陽(yáng)性結果的出現。但是，洗滌過(guò)度，也會(huì ) 造成細胞內擴增的產(chǎn)物被洗脫，是陽(yáng)性信號減弱或丟失。  有作者在擴增后用4%多聚甲醛2小時(shí)或2%戊二醛 5分鐘進(jìn)行后固定，以使擴增的產(chǎn)物在 檢測時(shí)能很好地保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。      原位檢測 原位PCR的擴增產(chǎn)物檢測方法，取決于原位PCR的設計方案，直接法則根 據標記分子的性質(zhì)對擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)行檢測。  4 原位PCR技術(shù)的應用       原位PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序 列。按照待測基因的性質(zhì)，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。  4.1用于外源性基因的檢測  4.1.1病毒基因的檢測      感染病毒的細胞常無(wú)較好的檢測手段，但當原位PCR技術(shù)應用后，使這一極為困難的 問(wèn)題有望解決。  對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀(guān)察到這些病毒 在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時(shí)發(fā)現受感染的人群。  4.1.2細菌基因的檢測      突出的應用是在結核桿菌的檢測上，當結核病變不夠典型時(shí)，經(jīng)過(guò)特殊染色的方法很 難在鏡下找到結核桿菌，而應用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷，當結核桿菌很少時(shí)仍能在 鏡下被很容易地找出來(lái)。  4.1.3導入基因的檢測      在轉基因動(dòng)物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體內，是否接受了導 入的基因，均可用原位PCR技術(shù)來(lái)證實(shí)。因此，原位PCR技術(shù)成為重要的檢測手段。  4.2 用于內源性基因的檢測  4.2.1異?；虻臋z測      機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，原癌基因，抑癌基因的突 變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無(wú)一均提供了廣闊的應用 前景。  4.2.2固有基因的檢測      對于機體細胞內只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術(shù)因基因拷貝數太 少而無(wú)能為力，液相PCR雖可進(jìn)行擴增檢測出來(lái)，但不能確定含有該基因的細胞類(lèi)型，原 位PCR技術(shù)則彌補了上述兩種技術(shù)的不足，使得我們能夠對人類(lèi)各種基因進(jìn)行檢測，而完 成人類(lèi)基因圖的繪制。

反向PCR

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來(lái)擴增兩引物以外的未知序列的片段，而 常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA的片段.實(shí)驗時(shí)選擇已知序列內部沒(méi)有切點(diǎn)的 限制性?xún)惹忻笇υ摱?/span>DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再 用一對反向的引物進(jìn)行PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分 析研究.   反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說(shuō)這一反應體系不是在一 對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未 知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA 區兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性?xún)惹忻该盖袠悠?/span> DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴增引物的上游片 段和下游片段；現已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線(xiàn)狀DNA的片段的雜交探針，這對 于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA的片段序列的識別十分重要。 PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端 序列未知的基因片段不擴增。    反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說(shuō)這一反應體系不是 在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接 的未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心 DNA區兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性?xún)惹忻该盖袠?/span> 品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴增引物的上游 片段和下游片段；現已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線(xiàn)狀DNA的片段的雜交探針，這 對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA的片段段序列的識別十分重要。   該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適的酶進(jìn) 行酶切才能得到合理大小的DNA的片段段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多 數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有 時(shí)也會(huì )有這些序列，這樣，通過(guò)反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。   利用反向PCR可對未知序列擴增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA的片段的序列， 并可將僅知部分序列的全長(cháng)cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長(cháng)的DNA探針。適用于基因游 走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點(diǎn)分析等研究。   用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大 小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實(shí)際上限為3-4kb。在許多情況下，首 先 需要進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定內切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴(lài)于引物)的上游 或上 游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環(huán)化類(lèi) 型決定的 接點(diǎn)(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時(shí) 好靠近識別 上個(gè)堿基位位的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向 PCR從含有大量不 同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。   用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗中，為產(chǎn)生對反 向 PCR大小適當的DNA的片段段需要兩種內切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，

環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內 切 酶失活。   聚合酶鏈反應條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物 退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？筛淖?/span>PCR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。 將反向 PCR用于測序時(shí)，與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增 部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴增引物的干擾。 描述一種大聚合酶鏈反應應用的方法，使在已知序列的核心區邊側的未知 成幾何級數 擴增 用適當的限制性?xún)惹辛呀夂诵膮^的，以產(chǎn)生適合于擴 增大小的片段，然后片段的 末端再連接形成環(huán)狀分子 的引物同源于環(huán)上核心區 的末端序列，但其方向性，使鏈的延 長(cháng)經(jīng)過(guò)環(huán)上的未知區而不是分開(kāi)引物的核心區 這種反向方法可用于擴增本來(lái)就在核心區 旁邊的序列，還可應用于制備未知序列 探針或測定邊側區域本身的上 下游序列 

逆轉錄PCR

1概念   RT-PCR 為反轉錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR） 共同的縮寫(xiě)。   逆轉錄PCR，或者稱(chēng)反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈 式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA， 再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴增。   由一條 RNA 單鏈轉錄為互補 DNA(cDNA)稱(chēng)作“逆轉錄”，由依賴(lài) RNA 的 DNA 聚 合酶（逆轉錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴(lài)DNA的DNA 聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下 互補DNA。   RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛 應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種 RNA 的含量。（檢測基因表達的方法， 參見(jiàn)Northern Blot法。）   RT-PCR有時(shí)候也會(huì )指代實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)。為了與逆轉錄PCR相區別，通常 被寫(xiě)作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。    時(shí)實(shí) PCR，屬于定量 PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內 DNA 的增幅量為基礎進(jìn) 行DNA的定量分析。   real time PCR 的定量使用螢光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特 異的螢光色素；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種螢光探 針（probe）。   real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合，能用微量的RNA來(lái)找出特定 時(shí)間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種 RT PCR 的組合又被稱(chēng)之為“定量 RT-PCR（quantitative RT-PCR）”   2 PCR各步驟的目的

2.1預變性：   破壞 DNA 中可能存在的較難破壞的二級結構。 使 DNA 充分變性，減少 DNA 復雜 結構對擴增的影響，以利于引物更好的和模板結合，特別是對于基因組來(lái)源的DNA模板，不要吝嗇這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng) Taq 酶的反應中，還可激活 Taq 酶，從 而使PCR反應得以順利進(jìn)行。 2.2變性--退火--延伸循環(huán)：   2.2．1模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙 鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應 作準備；   2．2.2模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃ 左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；   2.2.3 引物的延伸：DNA 模板--引物結合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 為 反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互 補的半保留復制鏈。 3用PCR儀擴增時(shí),(變性.退火,延伸)循環(huán)完成后,繼續 72度延伸了10分鐘的原因：   3.1.延伸時(shí)間取決于待擴增DNA的片段的長(cháng)度。（當然是在反應體系一定的條件下）例如， 使用taqDNA聚合酶，72度時(shí)的堿基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

   3.2.根據延伸速率推得，擴增1kb以?xún)鹊?/span>DNA的片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min， 依次照推。通常在zui后一輪要適當的將延伸時(shí)間延長(cháng)至 4-10min，這樣做是使 pcr 反應完 全以提高擴增產(chǎn)量。   3.3.繼續72度延伸了10分鐘除了可以使pcr反應*以提高擴增產(chǎn)量外，還有一個(gè)作 用是：在用普通 taq酶進(jìn)行 PCR擴增