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目的基因PCR擴增產(chǎn)物的克隆
[實(shí)驗原理]
1.PCR產(chǎn)物回收
在高離子鹽存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內的硅基質(zhì)膜上,再通過(guò)一系列
快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液,將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質(zhì)去除,后用低鹽,
高pH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
2.T載體與PCR產(chǎn)物的連接
源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組
的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中,將分別經(jīng)酶切
的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌
DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且
T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性,即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA
分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低,一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接
酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分
為3 步:首先,T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物;然后,酶-ATP復合物再結合
到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵,把
切口封起來(lái)。連接反應通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個(gè)端點(diǎn),所以切割時(shí)
出現兩種可能,一種是單酶切,另一種是雙酶切,這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。
對于單酶切來(lái)說(shuō),載體與供體的末端都相同,連接可以在任何末端之間進(jìn)行,這樣就導致了大量的
自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底,可對載體進(jìn)行5’除磷酸處理,原理是連接酶只能連接DNA
片斷的3’OH末端與5’端,所以除磷后載體不會(huì )自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí),由外源片斷提
供5’端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自身成環(huán)造成的高本底。對于雙
酶切來(lái)說(shuō),無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端,這樣就避免了載體與供體的自環(huán),能使有
效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。
連接反應的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩
定的。因此采取折中的溫度,即12-16℃,連接12-16h(過(guò)夜),這樣既可大限度地發(fā)揮連接
酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物,其DNA雙鏈前后末端
都有一個(gè)游離的A堿基,可以與T -Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。
[實(shí)驗材料、試劑和儀器]
PCR擴增相關(guān)試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像系統、
PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pUCm-T載體。
[實(shí)驗步驟]
1.PCR擴增
PCR反應體系:
注:每組做5管,其中4管用于PCR產(chǎn)物回收,1管作電泳檢測時(shí)的對照
PCR反應程序:
10×PCR Buffer 2.5 μl
dNTPs 0.5 μl
Taq 0.2 μl
引物1 1.5 μl
引物2 1.5 μl
ddH20 17.3 μl
DNA模板 1.5 μl
(聯(lián)系廣州市超博小凌取資料圖)
2.目的基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測
(1)制備瓊脂糖凝膠
稱(chēng)取0.2g瓊脂糖,放入錐形瓶中,加入20ml 1.0×TBE緩沖液,置微波爐或水浴加熱至*
溶化,取出搖勻,則為1%瓊脂糖凝膠液。
(2)取有機玻璃內槽,洗凈,晾干,用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好(一定封嚴,
不能留縫隙)。
(3)將有機玻璃內槽放置于一水平位置,并放好樣品梳子。
(4)將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液,緩緩倒入有機玻璃內槽,直至有機玻璃板上形成一層
均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。
(5)待膠凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在電泳槽內。
(6)加入電泳緩沖液至電泳槽中。
(7)用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔中(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量)。
1 94℃預變性 5min
2 94℃變性 45s
3 60℃退火 30s
4 72℃延伸 60s
2-4步驟,35 循環(huán)
5 72℃延伸 10min
6 4℃ 保存
(8)接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負極,DNA片段從負極向正極移動(dòng))。DNA的遷
移速度與電壓成正比,高電壓不超過(guò)5V/cm。當溴酚藍染料移動(dòng)到距凝膠前沿1~2cm處,停止
電泳。
3.產(chǎn)物回收
(1)在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下,放入1.5 mL Eppendorf離心管中;加入
500μl溶膠/結合液DB,充分混勻。
(2)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),室溫放置1 min,12000rpm
離心30-60s,倒掉收集管中的廢液。
(3)加入700μl漂洗液WB,12000rpm離心1min,棄掉廢液。
(4)加入500μl漂洗液WB,12000rpm離心1 min,棄掉廢液。
(5)將吸附柱AC 放回空收集管中,12000rpm離心 2 min,盡量除去漂洗液,以免漂洗液
中殘留乙醇抑制下游反應。
(6)取出吸附柱AC,放入一個(gè)干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液EB
(洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好),室溫放置2 min,12000rpm離心1 min。
如果需要較多量DNA,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱,離心1 min。
4.PCR產(chǎn)物與T載體的連接
對于常規的DNA ligase連接反應,請參考下面的連接反應體系,或按DNA ligase的說(shuō)明書(shū)
進(jìn)行操作。每個(gè)連接反應使用1μl pMD 18-T載體,約0.2pmol PCR產(chǎn)物,在10μl連接體系中
4℃連接過(guò)夜或室溫連接1h。
T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5μl
Purified PCR Product 1μl
pMD 18-T Vector 1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/微升) 1μl
ddH2O up to 10μl
5. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
① 挑取新鮮的E.coli.DH5α單菌落接種于一個(gè)含有10 ml LB液體培養基(不含抗生素)的試
管中,于37℃恒溫振蕩(200 rpm)培養約4h(OD=0.2~0.4),取出后立即將其冰浴10min。
② 在無(wú)菌條件下將冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無(wú)菌離心管中,于4℃下10000g
離心1min,回收細菌。
③ 每管中加入500 μl于4℃下預冷的CaCl2重懸沉淀,冰浴30min,于4℃下10000g離心
1min,回收細菌沉淀物。
④ 每管加入200 μl冰預冷的CaCl2,混勻即為感受態(tài)細胞,置4℃冰箱備用。
6. 重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌
① 取10 μl連接產(chǎn)物,加入內裝100 μl感受態(tài)細胞的離心管中,輕彈管壁混勻,冰浴30 min。
② 42℃熱擊90s后,迅速將離心管冰浴3~5min。
③ 加入1 ml不含抗生素的LB液體培養基,混勻,于37 ℃下振蕩培養(180 rpm)45 min。
④ 4℃下,10000 g,離心1 min,吸出500 μl上清液棄去,再混勻,取200 μl涂布于含有
100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養基平板上(事先涂布4μl濃度為200 mg/mg IPTG和20μl濃度
為40 mg/ml X-gal),待菌液被培養基*吸收后,倒置平板于37℃培養12~16h,直至出現單
菌落。再將培養皿置于4℃,使其*顯色(即出現藍、白斑)。
⑤ 連接產(chǎn)物轉化實(shí)驗的同時(shí),以等體積的ddH2O代替連接產(chǎn)物,其操作同上,分別涂布于含
抗生素和不含抗生素的LB平板上,分別作為陰性對照和陽(yáng)性對照。
7. 重組子克隆的鑒定(本部分視實(shí)驗進(jìn)程而定)
挑取可能含有目的片段的白斑,接種到5 ml LB/Amp液體培養基中,37℃ 220 rpm搖床培
養過(guò)夜。采用堿裂解法小量提取菌液質(zhì)粒DNA,進(jìn)行PCR擴增,檢測PCR產(chǎn)物是否連接到載體
中。
附:TBE電泳緩沖液的配制
5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml(pH 8.0)
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