目的基因PCR擴增產(chǎn)物的克隆

 [實(shí)驗原理]

1.PCR產(chǎn)物回收

在高離子鹽存在的情況下，DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內的硅基質(zhì)膜上，再通過(guò)一系列

快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液，將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質(zhì)去除，后用低鹽，

高pH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

2.T載體與PCR產(chǎn)物的連接

源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組

的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經(jīng)酶切

的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌

DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且

T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA

分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接

酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分

為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合

到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把

切口封起來(lái)。連接反應通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個(gè)端點(diǎn)，所以切割時(shí)

出現兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。

對于單酶切來(lái)說(shuō)，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導致了大量的

自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進(jìn)行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA

片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會(huì )自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提

供5’端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自身成環(huán)造成的高本底。對于雙

酶切來(lái)說(shuō)，無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有

效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩

定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可大限度地發(fā)揮連接

酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端

都有一個(gè)游離的A堿基，可以與T -Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。

[實(shí)驗材料、試劑和儀器]

PCR擴增相關(guān)試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像系統、

PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pUCm-T載體。

[實(shí)驗步驟]

1．PCR擴增

  PCR反應體系：

注：每組做5管，其中4管用于PCR產(chǎn)物回收，1管作電泳檢測時(shí)的對照

PCR反應程序：

10×PCR Buffer 2.5 μl

dNTPs 0.5 μl

Taq 0.2 μl

引物1 1.5 μl

引物2 1.5 μl

ddH20 17.3 μl

DNA模板 1.5 μl

(聯(lián)系廣州市超博小凌取資料圖)

2．目的基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測

（1）制備瓊脂糖凝膠

稱(chēng)取0.2g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入20ml 1.0×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至*

溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。

（2）取有機玻璃內槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好（一定封嚴，

不能留縫隙）。

（3）將有機玻璃內槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。

（4）將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層

均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。

（5）待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內。

（6）加入電泳緩沖液至電泳槽中。

（7）用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔中（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。

1 94℃預變性  5min

2 94℃變性 45s

3 60℃退火 30s

4 72℃延伸 60s

2－4步驟，35 循環(huán)

5 72℃延伸 10min

6 4℃ 保存

（8）接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動(dòng)）。DNA的遷

移速度與電壓成正比，高電壓不超過(guò)5V/cm。當溴酚藍染料移動(dòng)到距凝膠前沿1~2cm處，停止

電泳。

3．產(chǎn)物回收

（1）在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下，放入1.5 mL Eppendorf離心管中；加入

500μl溶膠/結合液DB，充分混勻。

（2）將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1 min，12000rpm

離心30-60s，倒掉收集管中的廢液。

（3）加入700μl漂洗液WB，12000rpm離心1min，棄掉廢液。

（4）加入500μl漂洗液WB，12000rpm離心1 min，棄掉廢液。

（5）將吸附柱AC 放回空收集管中，12000rpm離心 2 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液

中殘留乙醇抑制下游反應。

（6）取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液EB

（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2 min，12000rpm離心1 min。

如果需要較多量DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱，離心1 min。

4．PCR產(chǎn)物與T載體的連接

對于常規的DNA ligase連接反應，請參考下面的連接反應體系，或按DNA ligase的說(shuō)明書(shū)

進(jìn)行操作。每個(gè)連接反應使用1μl  pMD 18-T載體，約0.2pmol PCR產(chǎn)物，在10μl連接體系中

4℃連接過(guò)夜或室溫連接1h。

T4 DNA Ligase Buffer(2X)   5μl

Purified PCR Product          1μl

pMD 18-T Vector            1μl

T4 DNA Ligase (5-10U/微升)    1μl

ddH2O                      up to 10μl

5. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)

① 挑取新鮮的E.coli.DH5α單菌落接種于一個(gè)含有10 ml LB液體培養基（不含抗生素）的試

管中，于37℃恒溫振蕩（200 rpm）培養約4h(OD=0.2~0.4)，取出后立即將其冰浴10min。

② 在無(wú)菌條件下將冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無(wú)菌離心管中，于4℃下10000g

離心1min，回收細菌。

③ 每管中加入500 μl于4℃下預冷的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，于4℃下10000g離心

1min，回收細菌沉淀物。

④ 每管加入200 μl冰預冷的CaCl2，混勻即為感受態(tài)細胞，置4℃冰箱備用。

6. 重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌

① 取10 μl連接產(chǎn)物，加入內裝100 μl感受態(tài)細胞的離心管中，輕彈管壁混勻，冰浴30 min。

② 42℃熱擊90s后，迅速將離心管冰浴3~5min。

③ 加入1 ml不含抗生素的LB液體培養基，混勻，于37 ℃下振蕩培養（180 rpm）45 min。

④ 4℃下，10000 g，離心1 min，吸出500 μl上清液棄去，再混勻，取200 μl涂布于含有

100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養基平板上（事先涂布4μl濃度為200 mg/mg IPTG和20μl濃度

為40 mg/ml X-gal），待菌液被培養基*吸收后，倒置平板于37℃培養12~16h，直至出現單

菌落。再將培養皿置于4℃，使其*顯色（即出現藍、白斑）。

⑤ 連接產(chǎn)物轉化實(shí)驗的同時(shí)，以等體積的ddH2O代替連接產(chǎn)物，其操作同上，分別涂布于含

抗生素和不含抗生素的LB平板上，分別作為陰性對照和陽(yáng)性對照。

7. 重組子克隆的鑒定（本部分視實(shí)驗進(jìn)程而定）

挑取可能含有目的片段的白斑，接種到5 ml LB/Amp液體培養基中，37℃ 220 rpm搖床培

養過(guò)夜。采用堿裂解法小量提取菌液質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR擴增，檢測PCR產(chǎn)物是否連接到載體

中。

附：TBE電泳緩沖液的配制

5×TBE（5倍體積的TBE貯存液）

配1000ml 5×TBE：

Tris                      54g

硼酸                     27.5g

0.5mol/l EDTA             20ml（pH 8.0）