原位雜交實(shí)驗

1 探針的設計與合成

1) 根據實(shí)驗室已有的p8 基因cDNA全長(cháng)序列，用premier primer5.0設計引物p81和

p82，以鹵蟲(chóng) cDNA 為模板，PCR 擴增得到 346bp 的產(chǎn)物，用 Takara 膠回收試劑盒

回收純化。

引物編號 引物序列 長(cháng)度

p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp

p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp

2) 目的片段克隆

a. 在無(wú)菌離心管中加入連接載體的各種成分，載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8，根據凝

膠電泳檢測后的濃度及載體與片段分子大小來(lái)計算摩爾比。加入成分及比例如下：

目的PCR片段                    5 μl

pGM-T載體（約50ng/uL）         1 μl

10×T4 DNA Ligation Buffer         1 μl

T4 DNA Ligase（3U/uL）           1 μl

無(wú)菌去離子水                     3 μl

總體積                           10 μl

b. 輕輕彈動(dòng)離心管以混合內容物，短暫離心。置于 PCR 儀中 16℃過(guò)夜連接，反應結束后

將離心管置于冰上。

c. 向鋪好的含有氨芐青霉素的固體平板表面加入16 μl的IPTG （50mg/ml）、40 μl的X-gal

（20mg/ml），使用無(wú)菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開(kāi)，避光置于 37℃培養箱 1-3 小時(shí)，

使溶解X-gal的二甲基甲酰揮發(fā)干凈。

d. 將10 μl的連接產(chǎn)物加到100 μl DH5?感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴半小時(shí)，將離心

管置于 42℃水浴 90 秒，取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分鐘，其間不要搖動(dòng)離心管。

向離心管加入500 μl 37℃預熱的LB（不含抗生素）培養基，150rpm搖床37℃振蕩培養

45分鐘。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。將菌液于4000g下離心

10分鐘，去掉上清，加入100 μl培養液重溶并加入到配制好的LB固體培養基上，用無(wú)菌

的彎頭玻璃棒輕輕將細胞均勻涂開(kāi)。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養12-16小時(shí)。

e. 挑取白色菌落直接進(jìn)行PCR檢測，篩選轉化子。

f. 將轉化子接種于LB液體培養基中培養24小時(shí)，吸取1mL菌液送至大連寶生物公司進(jìn)行

序列測序。

3) 重組質(zhì)粒的線(xiàn)性化

取6 μl以測序的重組質(zhì)粒，選取NcoI內切酶37℃酶切4h。酶切反應體系為20 μl：

質(zhì)粒            6 μl

10xK Buffer      2 μl

NcoI酶          1 μl

0.1% BSA        2 μl

滅菌水          9 μl

終體積          20 μl

取酶切前后的質(zhì)粒各 4 μl，經(jīng) 1%瓊脂糖電泳檢測，確認酶切*，將酶切產(chǎn)物用 Takara

膠回收試劑盒回收純化，作為探針合成的模板。

4) 探針合成

按羅氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒使用指南，標記反義RNA探針。

使用的所有試劑和器皿均經(jīng)去 RNase 處理，合成方法如下:先準備反應體系。冰上向

RNase-Free的微離心管中順序加入下列試劑:

純化的線(xiàn)形質(zhì)粒              1 μg

Rnase-free dH2O                   up to 13 μl

10xNTP labeling mixture        2 μl

10xTranscription buffer         2 μl

Rnase inhibitor                1 μl

SP6 RNA Polymerase           2 μl

總體積                          20 μl

稍混勻，短暫離心將反應液集于管底，37℃ 2 h。反應結束后再補加2 μl DNase I，37℃ 15

min，反應結束后加入0.2M EDTA 2 μl 終止反應。取3-5 μl 反應產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳

檢測。-20℃保存備用。

2. 石蠟切片的制備

◆本實(shí)驗在雜交結束前均必須保證 RNase-free.玻璃器皿采用 180℃烘烤 10 小時(shí)。其它采

用DEPC處理，高溫滅菌鍋高溫降解DEPC。若儀器不能高溫處理，可用3%的H2O2處理

半小時(shí)以上，DEPC水沖洗干凈，烘干。

1) 組織的固定與包埋

選取不同發(fā)育時(shí)期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的鹵蟲(chóng)，經(jīng) DEPC

處理水沖洗表面鹽分后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，于4℃固定5-8 h，再分別按下列

順序進(jìn)行脫水、透明和包埋: 30%乙醇脫水1 h，50%乙醇脫水1 h，70%乙醇脫水1 h，80%

乙醇脫水乙醇脫水1 h，90%乙醇脫水1 h，無(wú)水乙醇脫水1 h，無(wú)水乙醇脫水1 h，無(wú)水乙

醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蠟(1:1)浸蠟30 min，54℃

石蠟浸蠟1 h，54℃石蠟包埋。

2) 組織切片：將包埋的組織按7 μm的厚度切片，在多聚賴(lài)氨酸處理的載玻片上滴加DEPC

處理水，組織片于42℃展片臺上展片1小時(shí)，再置于40℃恒溫箱中烘片12小時(shí)后放于4℃

密封保存備用。

3. 雜交前處理

切片經(jīng)二甲苯脫蠟2×15 min，無(wú)水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30%

乙醇脫水各5 min，后DEPC處理水2×5 min，然后進(jìn)行雜交前切片處理，具體步驟如下:

1) lxPBS(pH7.4)室溫孵育2x5 min。

2) 0.3%TtitonX-100 的PBS中去膜處理15 min。

3) lxPBS洗滌2x5 min。

4) 無(wú)RNase的蛋白酶K(20 ?g/mL)37℃消化30 min。

5) 100mMGly/PBS中洗 2x5 min。

6) lxPBS洗滌2x5 min。

7) 4%多聚甲醛(4℃)固定 5min。

8) lxPBS洗滌2x5 min。

9) 含有 0.25%(W/v)的乙酸酐的 100mM 的三乙醇胺緩沖液(pH8.0)去電荷處理 15

min(現配現用)。

10) lxPBS洗滌2x5 min。

4.預雜交和雜交

1) 滴加預雜交液于載玻片上，然后置于濕盒中，50℃預雜交2小時(shí)。

2) 棄去預雜交液，立即滴加雜交液，置于濕盒中52℃雜交過(guò)夜。

5.雜交后處理

雜交完，以后的步驟不必要特意防RNA酶。

1) 棄去雜交液，載片浸入2xSSC中2x15 min。

2) 載片浸入1xSSC中55℃水浴搖動(dòng)2x15 min。

3) 用含20?g/mL的RNaseA的NTE緩沖液37℃消化 30分鐘，以去除未結合的探針。

4) 載片浸入0.5xSSC中55℃水浴搖動(dòng)2x15 min。

5) 載片浸入0.5xSSC中室溫10 min。

6. 抗體反應

1) 用washing buffer清洗組織片5 min。

2) 滴加封閉液緩沖液室溫下處理組織片30 min。

3) 用抗體液覆蓋封閉后的組織片，置于濕盒中孵育3h以上。

4) Washing buffer 洗2x15 min。

5) Detection buffer 中平衡2-5 min。

7. 顯色：加入顯色液于濕盒中黑暗靜止顯色16h

8. 封片與觀(guān)察：

1) 顯色合適時(shí)，用TE buffer終止著(zhù)色反應，再用蒸餾水清洗。

2) 滴加封片劑封片，顯微鏡下觀(guān)察和攝影