石蠟切片制作(蘇木精-伊紅對染法)

實(shí)驗原理：

石蠟切片是基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發(fā)展起來(lái)的。

蘇木素與伊紅對比染色法（簡(jiǎn)稱(chēng) H.E.對染法）是組織切片常用的染色方法。這種方法適

用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著(zhù)色，便于全面觀(guān)察組織構造，而且適用于各種固

定液固定的材料，染色后不易褪色可長(cháng)期保存。經(jīng)過(guò)HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，

細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。

一、器材及試劑：

1. 器材：

切片刀，切片機，恒溫箱，蠟杯，酒精燈，解剖刀，解剖剪，解剖盤(pán)，培養皿，鑷子，

單面刀片，毛筆，包埋盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤(pán)，樹(shù)膠，樹(shù)膠瓶，顯微鏡，溫

度計，臉盆，水浴鍋。

切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精

燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。

2．試劑：

中性福爾馬林固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、蘇木精染液， 1%伊

紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，中性樹(shù)膠。

卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒

精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹(shù)

膠。

3. 材料：

鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、

莖、葉等。

二、實(shí)驗原理：

石蠟切片是基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發(fā)展起來(lái)

的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡(jiǎn)稱(chēng) H.E.對染法）是組織切片常用的染色方法。這種方

法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著(zhù)色，便于全面觀(guān)察組織構造，而且適用于各

種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長(cháng)期保存。經(jīng)過(guò)HE染色，細胞核被蘇木素染成藍

紫色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。

三、試劑配法：

1．中性甲醛固定液：

       甲醛（37%-40%，市售，本所購買(mǎi)即為此濃度）  100mL

       磷酸氫二鈉                                 6.5

       磷酸二氫鉀（鈉）                           4g       

雙蒸水                                    900mL                                     

2．蘇木精、伊紅染色液為碧云天產(chǎn)品

3．1%鹽酸乙醇液

鹽酸 1份

70%酒精 100 份

4．甘油蛋白貼片劑：

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水楊酸鈉（防腐劑） 1g

配制時(shí)將雞蛋一個(gè)打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然后

用粗紙或雙層紗布過(guò)濾到量筒中，經(jīng)數小時(shí)或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時(shí)在其中再加

等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用?？杀４鎺讉€(gè)月。

四、實(shí)驗步驟：

1．取材

頸椎脫臼法處死小鼠，打開(kāi)腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。

切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10

mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2－3mm厚。

注意事項：

（1）取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發(fā)生變化。

（2）切片材料應根據需要觀(guān)察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

2．固定

將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定，固定

30－50min。

注意事項：

（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化

學(xué)變化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之間會(huì )發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合

太早，固定時(shí)就沒(méi)有作用了。

（3）固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的 20~30 倍，有些水分多的材料，中

間應更換1-2次新液。

（4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標簽，并隨同材

料在溶液中投入相應的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來(lái)源、日期等。標簽

上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書(shū)寫(xiě)。

3. 洗滌

材料經(jīng)固定后,流水沖洗，數小時(shí)或過(guò)夜。

4. 脫水

材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各

2次，每次20min。各

注意事項：

（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。

（2）在更換高一級的脫水劑時(shí)，不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水

劑，再用吸水吸盡器皿內剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

（3）在低濃度酒精中，每級停留不宜太長(cháng)，否則易使組織變軟，助長(cháng)材料的解體。

（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時(shí)間也不宜太長(cháng)，否則會(huì )使組織變脆，影響切片。

（5）如需過(guò)夜，應停留在70%酒精中。

（6）脫水必須*，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象

5．透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。

由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過(guò)

二甲苯以過(guò)渡。當組織中全部被二甲苯占有時(shí)，光線(xiàn)可以透過(guò)，組織呈現出不同程度的透明

狀態(tài)。

透明注意事項

（1）使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。

（2）更換每級透明劑，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕

氣。

（3）在透明過(guò)程中， 如果材料周?chē)霈F白色霧狀，說(shuō)明材料中的水未被脫凈，應退回純

酒精中重新脫水，然后再透明。

6．透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程

度以便包埋。透蠟時(shí)間根據組織大小而定。透蠟應在恒溫箱內進(jìn)行，并保持箱內溫度在

55-60℃左右，注意溫度不要過(guò)高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h。

透蠟注意事項

（1）盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度；

（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速，力求在短的時(shí)間內完成石蠟透入過(guò)程，以免引起組織變硬、變脆、收

縮等。

7. 包埋

包埋時(shí)，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質(zhì)地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從

溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切

面朝下放入蠟模中，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。

8. 切片

①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。

②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

③搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過(guò)刀口。

④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。

⑥一切調整好后主可以開(kāi)始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶

提起，搖轉速度不可太急，通常以40-50r/min。

⑦切成的蠟帶到20-30cm長(cháng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成

帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀(guān)察切片是否

良好。

⑨切片工作結束后，應將切片刀取下用氯 FANG擦去刀上沾著(zhù)的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。

9. 展片、貼片

打開(kāi)水浴鍋，使水溫維持在40-45℃，另準備30%乙醇溶液。

① 切片時(shí)，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。

② 用小鑷子夾取預先用刀片割開(kāi)的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開(kāi)。

③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開(kāi)，用一個(gè)載玻片將切片完整，已展開(kāi)的切片撈至溫水

中，使之充分展開(kāi)。

④ 另取潔凈的載玻片，撈起展開(kāi)的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一

端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。

10. 脫蠟復水

    將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時(shí)，將切片連同切片架放入一干燥的染色

缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30min至蠟熔化。

之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、

70%各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。

11． 染色

切片放入蘇木精中染色約10-30min。

染色時(shí)間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長(cháng)。室溫高時(shí)促進(jìn)染色，

染色時(shí)間可短些，否則可適當延長(cháng)時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。

12．水洗

用自來(lái)水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可），但要注意流水

不能過(guò)大，以防切片脫落。

13．分化

將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數十秒鐘。見(jiàn)切片變紅，顏色較淺即可。

14．漂洗

切片再放入自來(lái)水流水中使其恢復藍色。

15．脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。

16、復染

用0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min。

伊紅主要染細胞質(zhì)，著(zhù)色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較

濃，細胞質(zhì)也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應淡染。

可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著(zhù)色，并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。

17．脫水Ⅱ

將切片放入 95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無(wú)水乙醇中 3-5min。后用吸水

紙吸干多余的乙醇。

18．透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

二甲苯應盡量保持無(wú)水，應經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。

切片如在二甲苯中出現白霧現象，說(shuō)明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡

檢。

19．封藏：中性樹(shù)膠封存

因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹(shù)膠作為封藏劑，樹(shù)膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。

封藏的方法：

封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張潔凈的

吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的

中央滴一滴樹(shù)膠（千萬(wàn)不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的

右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避

免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹(shù)膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過(guò)多，可在

干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹(shù)膠。

染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。