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熒光原位雜交實(shí)驗(FISH)

更新時(shí)間:2020-03-05瀏覽:1786次

                                熒光原位雜交實(shí)驗(FISH

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一門(mén)新興的分子細胞遺傳學(xué)

技術(shù),是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動(dòng)植物基因組結構研究、染色體精細結構

變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。

1實(shí)驗方法原理:

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一門(mén)新興的分子細胞遺傳學(xué)

技術(shù),是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動(dòng)植物基因組結構研究、染色體精細結構

變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH

的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針,按照堿基互補的原則,與待檢材料中未知的單

鏈核酸進(jìn)行異性結合,形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著(zhù)染

色體縱軸呈線(xiàn)性排列,因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定

位。與傳統的放射性標記原位雜交相比,熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性

高和可以多重染色等特點(diǎn),因此在分子細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分類(lèi)三類(lèi):1)染色體特異重復序列探針,例如α衛星、衛星III

類(lèi)的探針,其雜交靶位常大于1Mb,不含散在重復序列,與靶位結合緊密,雜交信號強,

易于檢測;2)全染色體或染色體區域特異性探針,其由一條染色體或染色體上某一區段上

不同的核苷酸片段所組成,可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得;3

特異性位置探針,由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。

探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素標記DNA探針,

雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測,同時(shí)還可以利用親和素-生物素

熒光素復合物,將熒光信號進(jìn)行放大,從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是將熒

光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結合,或在缺口平移法標記探針時(shí)將熒光素核苷

三磷酸摻入。直接標記法在檢測時(shí)步驟簡(jiǎn)單,但由于不能進(jìn)行信號放大,因此靈敏度不如間

接標記的方法。

2實(shí)驗材料、試劑、儀器耗材:

人的MyoD1MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本

指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20

恒溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL

移液器、暗盒等

3實(shí)驗步驟:

一、實(shí)驗材料準備

1. 實(shí)驗用具及材料

2. 相關(guān)溶液的配制

120×SSC175.3 g NaCl,88.2 g檸檬酸鈉,加水至1 000 mL(用10 mol/L NaOH

調pH 7.0)。

2)去離子甲酰胺(DF):將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪

30 min,用Whatman l號濾紙濾。

3)體積分數70%甲酰胺/2×SSC35 mL甲酰胺,5 mL 20×SSC,10 mL水。

4)體積分數50%甲酰胺/2×SSC100 mL甲酰胺,20 mL 20×SSC,80 mL水。

5)體積分數50%硫酸葡聚糖(DS):65℃水浴中融化,4℃或-20℃保存。

6)雜交液:8 μL體積分數25%DS,20 μL 20×SSC混合。(或40 μL體積分數50% DS,

20 μL 20×SSC,40 μL ddH2O混合)取上述混合液50 μL,與5 μL DF混合即成。其終

濃度為體積分數10% DS,2×SSC,體積分數50% DF。

7PI/antifade溶液

PI原液:先以雙蒸水配置溶液,濃度為100 μg/mL,取出1 mL,加39 mL雙蒸水,使終

濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液:以PBS緩沖液配制該溶液,使其濃度為10 mg/mL,

0.5 mmol/LNaHCO3調pH 值為8.0。取上述溶液1 mL,加9 mL甘油,混勻。

PI/antifade溶液:PIantifade原液按體積比1:9比例充分混勻,-20℃保存備用。

8DAPI/antifade溶液:用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液,按體積比1:300,以

antifade溶液稀釋成工作液。

9)封閉液I:體積分數5% BSA 3 mL,20×SSC 1 mL,ddH2O 1mL,Tween20 5 μL

混合。

10)封閉液II:體積分數5% BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250 μL,ddH2O

750 μL,Tween20 5 μL混合。

11)熒光檢測試劑稀釋液:體積分數5% BSA 1mL,20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,

Tween20 5μL混合。

12)洗脫液:100 mL 20×SSC,加水至500 mL,加Tween20 500 μL。

二、實(shí)驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min,立即置0℃,510 min,使雙鏈 DNA探針變性。

 

2. 標本變性

1)將制備好的染色體玻片標本于50℃培養箱中烤片23 h。(經(jīng)Giemsa染色的標本

需預先在固定液中退色后再烤片)。

2)取出玻片標本,將其浸在7075℃的體積分數70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性

23 min。 

3)立即按順序將標本經(jīng)體積分數70%、體積分數90%和體積分數100%冰乙醇系列脫

水,每次5 min,然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上,蓋上18×18蓋玻

片,用Parafilm封片,置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜(約1517 h)。由于雜交液較少,

而且雜交溫度較高,持續時(shí)間又長(cháng),因此為了保持標本的濕潤狀態(tài),此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。

 

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結合的探針,從而降低本底。

1 雜交次日,將標本從37℃溫箱中取出,用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。 

2 將已雜交的玻片標本放置于已預熱4250℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌

3次,每次5 min。

3 在已預熱4250℃的1×SSC中洗滌3次,每次5 min。

4 在室溫下,將玻片標本于2×SSC中輕洗一下。 

5 取出玻片,自然干燥。 

6 200 μL復染溶液(PI/antifadeDAPI/antifade染液)滴加在玻片標本上,蓋

上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大(適用于使用生物素標記的探針)

1 在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I,用保鮮膜覆蓋,37℃溫育20min。

2 去掉保鮮膜,再加150 μL avidin-FITC于標本上,用保鮮膜覆蓋,37℃繼續溫育40

min。

3 取出標本,將其放入已預熱4250℃的洗脫液中洗滌3次,每次5 min。

4 在玻片標本的雜交部位加150 μL封閉液II,覆蓋保鮮膜,37℃溫育20 min。

5 去掉保鮮膜,加150 μL antiavidin于標本上,覆蓋新的保鮮膜,37℃溫育40 min。

6 取出標本,將其放入已預熱4250℃的新洗脫液中,洗滌3次,每次5 min。

7 重復步驟(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室溫清洗一下。 

8 取出玻片,自然干燥。 

9 200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上,蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類(lèi)型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol(可使封片液產(chǎn)生自封閉作用),

為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā),可使用指甲油將蓋片周?chē)忾]。封好的玻片標本可以在

-20-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

7. 熒光顯微鏡觀(guān)察FISH結果

先在可見(jiàn)光源下找到具有細胞分裂相的視野,然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源,FITC的激發(fā)波長(cháng)為

490 nm。細胞被PI染成紅色,而經(jīng)FITC標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(cháng)及濾光鏡選擇。

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