熒光原位雜交實(shí)驗（FISH）

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細胞遺傳學(xué)

技術(shù)，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動(dòng)植物基因組結構研究、染色體精細結構

變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。

1實(shí)驗方法原理：

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細胞遺傳學(xué)

技術(shù)，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放

射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動(dòng)植物基因組結構研究、染色體精細結構

變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH

的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單

鏈核酸進(jìn)行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著(zhù)染

色體縱軸呈線(xiàn)性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定

位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性

高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分類(lèi)三類(lèi)：1）染色體特異重復序列探針，例如α衛星、衛星III

類(lèi)的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位結合緊密，雜交信號強，

易于檢測；2）全染色體或染色體區域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區段上

不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）

特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。

探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物素標記DNA探針，

雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和素-生物素

熒光素復合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標記法是將熒

光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結合，或在缺口平移法標記探針時(shí)將熒光素核苷

三磷酸摻入。直接標記法在檢測時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間

接標記的方法。

2實(shí)驗材料、試劑、儀器耗材：

人的MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本

指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20等

恒溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL

移液器、暗盒等

3實(shí)驗步驟：

一、實(shí)驗材料準備

1. 實(shí)驗用具及材料

2. 相關(guān)溶液的配制

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH

調pH 至7.0）。

（2）去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪

拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

（3）體積分數70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

（4）體積分數50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

（5）體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

（6）雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，

20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終

濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

（7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終

濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，

用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH 值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20℃保存備用。

（8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以

antifade溶液稀釋成工作液。

（9）封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL

混合。

（10）封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O

750 μL，Tween20 5 μL混合。

（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，

Tween20 5μL混合。

（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

二、實(shí)驗方法及步驟

1. 探針變性

將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈 DNA探針變性。

2. 標本變性

（1）將制備好的染色體玻片標本于50℃培養箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標本

需預先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標本，將其浸在70～75℃的體積分數70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性

2～3 min。 

（3）立即按順序將標本經(jīng)體積分數70%、體積分數90%和體積分數100%冰乙醇系列脫

水，每次5 min，然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻

片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜（約15～17 h）。由于雜交液較少，

而且雜交溫度較高，持續時(shí)間又長(cháng)，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。 

（2） 將已雜交的玻片標本放置于已預熱42～50℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌

3次，每次5 min。

（3） 在已預熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。

（4） 在室溫下，將玻片標本于2×SSC中輕洗一下。 

（5） 取出玻片，自然干燥。 

（6） 取200 μL復染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標本上，蓋

上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2） 去掉保鮮膜，再加150 μL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續溫育40

min。

（3） 取出標本，將其放入已預熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。

（4） 在玻片標本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。

（5） 去掉保鮮膜，加150 μL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。

（6） 取出標本，將其放入已預熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。

（7） 重復步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 

（8） 取出玻片，自然干燥。 

（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類(lèi)型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），

為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周?chē)忾]。封好的玻片標本可以在

-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

7. 熒光顯微鏡觀(guān)察FISH結果

先在可見(jiàn)光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源，FITC的激發(fā)波長(cháng)為

490 nm。細胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(cháng)及濾光鏡選擇。