siRNA表達載體的構建 

siRNA 表達載體構建可以：（1）作為后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具；（2）應用于

基因組學(xué)、細胞信號傳導通路分析；（3）用于藥物靶點(diǎn)篩選、疾病治療。 

實(shí)驗方法原理: 

多數的 siRNA 表達載體依賴(lài)三種 RNA 聚合酶 III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的

發(fā)夾RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細胞中的表達。這三類(lèi)啟動(dòng)子包括大家

熟悉的人源和鼠源的 U6 啟動(dòng)子和人 H1 啟動(dòng)子。之所以采用 RNA polIII 啟動(dòng)子是由于它

可以在哺乳動(dòng)物細胞中表達更多的小分子 RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3 到 6 個(gè)）U 來(lái)

終止轉錄的。要使用這類(lèi)載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，

克隆到相應載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆 ，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數月的時(shí)

間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測序以保證克隆 的序列是正確的。 

實(shí)驗材料: 

目的基因 

試劑、試劑盒： 

LB培養基 

儀器、耗材： 

離心管、離心機、水浴鍋、漩渦振蕩儀等 

實(shí)驗步驟： 

一、目的基因的確定 

1.  檢索文獻獲取有實(shí)驗證明有效的靶點(diǎn)序列（核對）。 

2.  NCBI查閱：聯(lián)系超博獲取

3.  搜索引擎輔助：聯(lián)系超博獲取

二 、設計siRNA靶序列 

在制備 siRNA 前都需要單獨設計 siRNA 序列.研究發(fā)現對哺乳動(dòng)物細胞,有效的 siRNAs

是 21-23 個(gè)堿基大小、3’端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈 RNA；而對非哺乳動(dòng)物，比較有效的

是長(cháng)片段 dsRNA。siRNA 的序列專(zhuān)一性要求非常嚴謹，與靶 mRNA 之間一個(gè)堿基錯配都

會(huì )顯著(zhù)削弱基因沉默的效果。 

1.  選擇siRNA靶位點(diǎn) 

從轉錄AUG起始密碼子開(kāi)始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷

酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那

些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時(shí)不要針對5'和3'端的非編碼區

（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR

結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會(huì )影響 siRNP 核酸內切酶復合物結合 mRNA 從而影響

siRNA的效果。 

2.  序列同源性分析 

將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人或者小鼠、大鼠等等）進(jìn)行比較,排除那些和其他

編碼序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST（聯(lián)系超博獲?。┻x出合

適的目標序列進(jìn)行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位

置效應的結果,因此對于一個(gè)目的基因，一般要選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)來(lái)設計siRNA。 

通常來(lái)說(shuō)，每個(gè)目標序列設計3-4對siRNAs，選擇有效的進(jìn)行后續研究。 

3.  設計陰性對照 

一個(gè)完整的 siRNA 實(shí)驗應該有陰性對照，作為陰性對照的 siRNA 應該和選中的 siRNA 序

列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿

基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒(méi)有同源性。 

三、表達載體的選用 

1.  化學(xué)合成與體外轉錄方法都是在體外得到 siRNA 后再導入細胞內，但是這兩種方法主

要有兩方面無(wú)法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細胞后容易被降解；進(jìn)入細胞siRNA在細胞內的

RNAi 效應持續時(shí)間短.針對這種情況，出現了質(zhì)粒、病毒類(lèi)載體介導的 siRNA 體內表達。

該方法的基本思路是：將 siRNA 對應的 DNA 雙鏈模板序列克隆入載體的 RNA 聚合酶 III

的啟動(dòng)子后，這樣就能在體內表達所需的 siRNA 分子。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直

接操作RNA，能達到較長(cháng)時(shí)間的基因沉默效果。 

2.  通過(guò)質(zhì)粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA(small hairpin RNA)的

序列。選用 Pol III 啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始

轉錄合成 RNA，遇到 4—5 個(gè)連續的 U 即終止，非常精確。當這種帶有 Pol III 啟動(dòng)子和

shRNA模板序列的質(zhì)粒轉染哺乳動(dòng)物細胞時(shí)，這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調特定

基因的表達，可抑制外源基因和內源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò) siRNA 表達質(zhì)粒的

選擇標記，siRNA 載體能夠更長(cháng)時(shí)間地抑制目的基因表達。當然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)

?？梢詮椭茢U增，相比起其它合成方法來(lái)說(shuō)，這就能夠顯著(zhù)降低制備siRNA的成本。 

3.  帶有抗生素標記的 siRNA 表達載體可用于長(cháng)期抑制研究，通過(guò)抗性輔助篩選，該質(zhì)粒

可以在細胞中持續抑制靶基因的表達數星期甚至更久。同時(shí) RNAi-Ready 表達載體還能與

逆轉錄病毒和腺病毒表達系統整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表達

載體對宿主細胞的侵染性,*克服某些細胞轉染效率低的障礙，是實(shí)現哺乳動(dòng)物細胞

siRNAs瞬時(shí)表達與穩定表 達的理想工具。 

四、合成模板 

1.  合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄

中止位點(diǎn)，同時(shí)兩端分別設計 BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)，可以克隆到 siRNA 載體多

克隆位點(diǎn)的 BamH I 和 Hind III 酶切位點(diǎn)之間。 

2.  95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。 

五、連接與轉化 

1.  將100 μl感受態(tài)細胞于冰上解凍。 

2.  取 5 μl 連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內容物，在冰上放置 30

分鐘。 

3.  將管放入預加溫到 42℃的水浴中，熱激 90 秒?？焖賹⒐苻D移到冰浴中，使細胞冷卻

1~2分鐘。 

4.  每管中加700 μl LB培養基，37℃振蕩培養1小時(shí)，進(jìn)行復蘇。 

5.  室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100 μl培養基重懸細胞并涂布到含

抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細胞用量應根據連接效率和感受態(tài)細胞的效率進(jìn)行調整。 

6.  將平板置于室溫直至液體被吸收。 

7.  倒置平皿，于37℃培養，12~16小時(shí)后可出現菌落。 

六、PCR鑒定和測序鑒定 

在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側設計鑒定PCR引物，擴增片段在100-200bp之

間。 

注意事項： 

1. 從轉錄本（mRNA）的 AUG 起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其 3’端的

19 個(gè)堿基序列，作為潛在的 siRNA 靶位點(diǎn)。有研究結果顯示 GC 含量在 30%—50%左右

的siRNA要比那些GC 含量偏高的更為有效。 

Tuschl等建議在設計siRNA時(shí)不要針對5’和 3’端的非編碼區（untranslated regions，

UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些 UTR 結合蛋白或者翻譯起始

復合物可能會(huì )影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。 

2. 將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些

和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（聯(lián)系超博獲?。?/span> 

3.  選出合適的目標序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設計多個(gè)靶序列的siRNA，以找到

有效的siRNA序列。 

4.  一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗應該有負對照，作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列

有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，

同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒(méi)有同源性。 

如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個(gè)堿基序列，廠(chǎng)家會(huì )合成一對互

補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結尾，如果要UU結尾的話(huà)通常要特

別說(shuō)明。有結果顯示，UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒(méi)有區別。因為這個(gè)突出端

無(wú)需和靶序列互補。 

其他： 

一、siRNA操作成功要點(diǎn)  

1. 對每個(gè)基因設計并檢測兩到四個(gè)siRNA序列 

為了找到潛在靶位點(diǎn)，掃描靶基因中的 AA 序列。記錄每個(gè) AA 3’端 19 個(gè)核苷酸作為潛

在 siRNA 靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)需通過(guò) GENBANK 數據庫的 BLAST 分析，去除那些與其它

基因明顯同源的靶位點(diǎn)。如果可能，siRNA應根據mRNA低二級結構的區域設計。 

2.  選擇低GC含量的siRNA 

Ambion公司研究發(fā)現GC 含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。 

3.  純化體外轉錄siRNA 

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗

脫(Ambion siRNA 體外合成試劑盒中已包括純化柱保證 siRNA 純度)或通過(guò) 15-20%丙烯

酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的 RNA

通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。 

4.  避免RNA酶污染 

微量的RNA酶將導致siRNA實(shí)驗失敗。由于實(shí)驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，

所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實(shí)驗每個(gè)步驟不受 RNA 酶污染非

常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產(chǎn)品線(xiàn)，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢

測和去除RNA酶。 

5.  健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實(shí)驗所用細胞的穩定性。

為了優(yōu)化實(shí)驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會(huì )隨時(shí)間明顯下降。 

6. 避免適用抗生素 

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢?huì )在穿透的細

胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在 siRNA 轉染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可

同時(shí)用正常培養基和無(wú)血清培養基做對比實(shí)驗，以得到好轉染效果。QIAGEN 推出的專(zhuān)

門(mén)針對RNA轉染的試劑 

7.  選擇好的轉染試劑轉染siRNA 

針對靶細胞類(lèi)型，選擇好的轉染試劑和優(yōu)化的操作對 siRNA 實(shí)驗的成功至關(guān)重要。siRNA

實(shí)驗要求選擇適合轉小的 RNA 的轉染試劑(目前大多數轉染試劑都針對轉染比較大的質(zhì)粒

DNA，而非小的 RNA 分子，宿主范圍大小也不同)。Ambion 公司的 Silencer siRNA 

Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專(zhuān)門(mén)針對轉

siRNA優(yōu)化的轉染試劑，是您的理想選擇。 

8.  通過(guò)合適的陽(yáng)性對照優(yōu)化轉染和檢測條件 

對大多數細胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對照。將不同濃度的陽(yáng)性對照的siRNA轉入靶細胞(同

樣適合實(shí)驗靶siRNA)，轉染48小時(shí)后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水

平。過(guò)多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽(yáng)性siRNA。 

9.  通過(guò)陰性對照siRNA排除非特異性影響 

合適的陰性對照可通過(guò)打亂活性 siRNA 的核苷酸順序設計而得。必須注意它要進(jìn)行同源比

較確保相對所要研究的生物的基因組沒(méi)有同源性。 

10.  通過(guò)標記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗 

熒光標記的 siRNA 能用來(lái)分析 siRNA 穩定性和轉染效率。標記的siRNA 還可用作 siRNA

胞內定位及雙標記實(shí)驗(配合標記抗體)來(lái)追蹤轉染過(guò)程中導入了 siRNA 的細胞，將轉染與

靶蛋白表達的下調結合起來(lái)。