RNA干擾實(shí)驗

（如需詳細資料，請聯(lián)系超博科技小凌）

一、磷酸鈣轉染法

【實(shí) 驗 原 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法。磷酸鈣

有利于促進(jìn)外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過(guò)胞飲

作用進(jìn)入靶細胞，被轉染的DNA可以在細胞內進(jìn)行瞬時(shí)表達，也可整合到靶細胞的染色體

上從而產(chǎn)生不同基因型和表型的穩定克隆。該方法可廣泛用于轉染許多不同類(lèi)型的細胞。 

【儀器、材料和試劑】

（一）儀器、用具

CO2培養箱、10cm細胞培養平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml錐形管、燒杯、量筒

等。 

（二）材料

呈指數生長(cháng)的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質(zhì)粒DNA

（三）試劑

1．*培養液 

DMEM 90ml

FCS 10ml

2．2M CaCl2，過(guò)濾除菌，-20℃保存備用

3．2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

用NaOH調pH至6.95，過(guò)濾除菌后，-20℃保存備用。

【方法與步驟】

1．在10cm的培養板上接種1×106個(gè)BALB/c 3T3細胞

第二天進(jìn)行轉染

2．準備CaPO4沉淀

2.1 準備兩組試管

在A管中加入： 15μg質(zhì)粒DNA

69μl 2M CaCl2 

460μl重蒸水

在B管中加入： 550μl 2×HEBS 

2.2 用巴斯德吸管將 A 管中的溶液緩慢地逐滴加入在 B 管中，同時(shí)用另一吸管吹打 B 管溶

液，整個(gè)過(guò)程需緩慢進(jìn)行，至少需持續1～2min。 

2.3室溫靜置30min，出現細小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養細胞的10cm平板中，輕輕晃動(dòng)（此過(guò)程需盡快完成）。

4. 在5%CO2的加濕培養箱中培養細胞2-6 hr。

5. 除去培養液，加入10ml*培養液培養細胞1-6天（依具體情況而定）。

6. 收集細胞進(jìn)行基因活性的檢測，或分散接種到其他培養皿中進(jìn)行選擇培養。

【注 意 事 項】

1．在整個(gè)轉染過(guò)程中要保持無(wú)菌操作。

2．在實(shí)驗中使用的各種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量。

3．質(zhì)粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉淀后的DNA應保持無(wú)菌，在無(wú)菌水或Tris- EDTA中

溶解。

4．沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2

溶液時(shí)需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地黏附

和進(jìn)入細胞。

二、電穿孔和電融合技術(shù)

[實(shí)驗原理]

當細胞置于非常高的電場(chǎng)中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進(jìn)細胞內，這

一現象稱(chēng)為電穿孔。運用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和

熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉導方法，電穿孔已被廣泛用于各種細胞類(lèi)型，包括

細菌、酵母、植物和動(dòng)物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱(chēng)為電注射），把各種外源物

質(zhì)引入活細胞。與其他常用的導入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，不必

象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓和昂貴的設備，可以一次對成百萬(wàn)的細胞進(jìn)行注

射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒(méi)有生物或化學(xué)副作用。第三，因為電穿孔是一

種物理方法，較少依賴(lài)細胞類(lèi)型，因而應用廣泛。實(shí)際上，對大多數細胞類(lèi)型，用電穿孔法

基因的轉移效率比化學(xué)方法高得多。 

除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場(chǎng)脈沖也能引起

細胞融合，這一現象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一

電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細胞相互融合制備動(dòng)物克隆方面非常有用，尤

其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個(gè)實(shí)驗室已證明使用電場(chǎng)電融合效率

比常規的化學(xué)融合方法高10到100倍，近來(lái)，貼壁細胞的電融合還被用來(lái)研究細胞融合時(shí)

細胞的骨架成分和細胞器的動(dòng)力學(xué)重排。

[儀器、材料和試劑]

（一）儀器：

脈沖發(fā)生器，樣品池：一個(gè)盛細胞的容器和兩個(gè)平行的金屬電極，CO2 培養箱，離心機，

顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細管，離心管等。 

（二）材料：

（三）試劑：

穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）

10mmol/L HEPES 調節pH至7.3

融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 調節pH 至

7.3

[方法與步驟]

一．懸浮細胞的電穿孔法：

1電穿孔進(jìn)行基因轉移

電穿孔可用于將多種不同類(lèi)型的分子載入活細胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉

移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進(jìn)行，只需把外源DNA換頁(yè)所需分子即可。

1.1 使細胞在適宜的培養基中生長(cháng)，用胰酶處理，收獲對數生長(cháng)中期的細胞，并用腺酶處

理。

1.2 在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細胞時(shí)，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，

使得懸浮細胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細胞。

1.3 計數細胞，在PM 中，濃縮細胞為大約1千萬(wàn)細胞/ml。

1.4 將 DNA 加到細胞懸液中，充分混合，使 DNA 均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞

-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。

1.5 在電穿孔裝置上設置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數衰減函數的時(shí)間常數，即

τ=RC，C 是電容，R 是樣品的電阻）。假如設備是 CD 脈沖型發(fā)生器，設定電容和并聯(lián)電

阻，以達到合適的τ值。 

1.6 將小池放進(jìn)盛樣品的池中，啟動(dòng)電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。

1.7 電處理后，向小池加1ml普通培養基，將細胞混合液從小池轉移到組織培養容器（培

養皿或培養孔）中，再加入一些培養基使之后的培養基體積適量。然后，將樣品細胞放回孵

育箱中使之在正常條件下生長(cháng)。

1.8 在測定轉移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養的時(shí)間不同。

2檢測電穿孔效率和細胞存活率

2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替 DNA 外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖

引入目標細胞的方法如前所述。

2.2 電穿孔后，用培養基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。 

2.3 電穿孔后30min，向細胞懸液中加30μl臺盼藍，孵育2min，然后用培養基洗滌。

2.4 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸于PM中，終體積100μl。

2.5 將一滴細胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定

攝取熒光標記葡聚糖的百分數。

2.6 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了臺盼藍），測定細胞存活的百分

數。

2.7 在各種電場(chǎng)設定值下重復實(shí)驗，畫(huà)出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數的曲線(xiàn)。

這一曲線(xiàn)就將顯示對特定細胞類(lèi)型電穿孔的zui優(yōu)條件。

二．懸浮生長(cháng)細胞的電融合 

融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類(lèi)似，只是在進(jìn)行高強度的電場(chǎng)脈沖前后，必須用低幅、

高頻電場(chǎng)使細胞排成一條鏈。

1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細胞兩次，然后懸于 FM 中。洗滌細胞時(shí)，在臺式離心機上

1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉淀，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。

2 將懸浮細胞轉移到相應的融合室內。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉移前要充分

混合。

3 啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以?xún)?，用顯微鏡檢測細胞是

否排成一條鏈，調節振幅和頻率以達到zui佳效果。

4 讓介電電泳場(chǎng)開(kāi)約 1 分鐘后關(guān)掉，立即應用融合脈沖，其振幅數量級為 1kV/cm。脈沖

寬度小于1ms。在進(jìn)行融合脈沖后立即再次啟動(dòng)介電電泳場(chǎng)，常規讓其開(kāi)啟約2分鐘。

5 關(guān)掉介電電泳場(chǎng)，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。

6 去掉FM，用普通培養基再次洗滌細胞。

7 將細胞轉移到培養皿，加入普通培養基，在培養箱一般條件下培養。

[注意事項]

1 Zui優(yōu)組分依使用的特定細胞種類(lèi)而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔

結果仍不令人滿(mǎn)意，就應嘗試改變穿孔介質(zhì)。

2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態(tài)有關(guān)，為達到zui高效率，必須收集對數生

長(cháng)中期的細胞。

1.純化siRNA 

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗

脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注

意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。 

2.避免RNA酶污染 

微量的RNA酶將導致siRNA實(shí)驗失敗。由于實(shí)驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，

所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗每個(gè)步驟不受RNA酶污染非

常重要。

3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實(shí)驗所用細胞的穩定性。

為了優(yōu)化實(shí)驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會(huì )隨時(shí)間明顯下降。 

4.避免使用抗生素 

抗生素會(huì )在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時(shí)需要無(wú)血清的條

件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養基和無(wú)血清培養基做對比實(shí)驗，以得到zui佳轉染效果。

5.選擇合適的轉染試劑 

針對siRNA制備方法以及靶細胞類(lèi)型的不同，選擇好的轉染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實(shí)

驗的成功至關(guān)重要。 

6.通過(guò)合適的陽(yáng)性對照優(yōu)化轉染和檢測條件 

對大多數細胞，看家基因是較好的陽(yáng)性對照。將不同濃度的陽(yáng)性對照的siRNA轉入靶細胞

（同樣適合實(shí)驗靶siRNA），轉染48小時(shí)后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降

低水平。過(guò)多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過(guò)標記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗 

熒光標記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA

胞內定位及雙標記實(shí)驗（配合標記抗體）來(lái)追蹤轉染過(guò)程中導入了siRNA的細胞，將轉染

與靶蛋白表達的下調結合起來(lái)。

RNAi研究的一般技術(shù)路線(xiàn)是：