Northern Blot原理及實(shí)驗方法 

原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而將在凝膠中的位置轉移

到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的RNA探針進(jìn)行反應。

用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。  

實(shí)驗方法： 

[儀器、試劑、材料] 

（一）儀器恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統，真空轉移儀，真空泵，UV交聯(lián)儀，雜交

爐，恒溫搖床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離

心管，燒杯，量筒，三角瓶等。 

（二）材料總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA(25 ng)，尼龍膜 

（三）試劑：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，

底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free 

Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水,滅菌水等。 

[方法與步驟] 

1.用具的準備： 

180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時(shí)。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用

雙氧水浸泡過(guò)夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。處理DEPC水(2 L)備用。 

2．用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子，電泳槽，刀片等，

然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。 

3．制膠：  

1． 稱(chēng)取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完

全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發(fā)的水分) 

 2． 在通風(fēng)廚中加入3.6ml 的10＊Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。注意盡量避

免產(chǎn)生氣泡。 

3． 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方

法去除，或將氣泡推到膠的邊緣。注：膠的厚度不能超過(guò)0.5cm。 

4．膠在室溫下*凝固后，將膠轉移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋

過(guò)膠面約1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1×MOPS Gel Running buffer，在電泳過(guò)

程中補充蒸發(fā)的buffer。） 

5．檢查點(diǎn)樣孔。 

4. RNA樣品的制備 

在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB（終濃度為10ug/ml）。

混勻后，65℃空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。 

5.電泳： 

1.將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。 

2.在5V/cm 下跑膠（5ｘ14cm）。在電泳過(guò)程中，每隔30min 短暫停止電泳，取出膠，混

勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍（500bp）接近膠的邊緣時(shí)終止電泳。 

3.紫外燈下，檢驗電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點(diǎn)樣孔的距離。注意不要

讓膠在紫外燈下曝光太長(cháng)時(shí)間。 

6.轉膜 

1．用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后，用DEPC水沖洗。 

2．用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。 

3．連接真空泵和真空轉移儀，剪取一塊適當大小的膜（膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的

5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當位置。 

4．蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。 

5．將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過(guò)塑膠屏孔，并至少蓋過(guò)邊緣約2mm，以

防止漏氣。 

6．將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。 

7．打開(kāi)真空泵，使壓強維持在50~58mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每

隔10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉移2小時(shí)。 

8．轉膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余

的膠和鹽。 

9．用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動(dòng)交聯(lián)。 

10．將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長(cháng)的紫外曝光時(shí)間) 

12．將膜在-20℃保存。 

7.探針的制備 

1．在1.5ml離心管中配制以下反應液：模板DNA(25 ng)    1ul 

Random Primer 2ul滅菌水 11ul總體積：14ul 

2．95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。 

3．在離心管中按下列順序加入以下溶液： 

10×Buffer 2.5ul 

dNTP Mixture 2.5ul 

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul 

Exo-free Klenow Fragment 1 ul 

4．混勻后（25ul）， 37°C下反應30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。 

5．65°C加熱5min使酶失活。    

8.探針的純化及比活性測定： 

1．準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過(guò)夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠

數次，以除去可溶解的葡聚糖。 

2．取1ml一次性注射器，去除內芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器

中裝填Sephadex G-50凝膠。 

3．將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝

膠壓緊后，補加Sephadex G-50凝膠懸液，重復此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度

處 

4．100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復3次。 

5．倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50

凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。 

6．將標記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8 paper上，其余上樣于層

析柱上。 

7．1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則

保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-paper. 

 8． 測比活性。  

9．預雜交： 

1．將預雜交液在雜交爐中68℃預熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。 

2．加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2膜面積加入10mlULRAhyb雜交液)，42℃

預雜交4 hr。 

10．探針變性： 

1．用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。 

2．90℃熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。 

3．短暫離心，將溶液收集到管底。 

11．雜交： 

1．加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預雜交液中。 

2．42℃雜交過(guò)夜（14~24hr）。雜交完后，將雜交液收集起來(lái)于－20℃保存。 

12．洗膜：  

1．低嚴緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗

膜溶液)，室溫下，搖動(dòng)洗膜5min兩次。  

2．高嚴緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml

洗膜溶液)，42℃ 搖動(dòng)洗膜20min兩次。  

13．曝光： 

1． 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。 

2． 檢查膜上放射性強度，估計曝光時(shí)間 

3． 將X光底片覆蓋與膜上，曝光 

4． 沖洗X光底片，掃描記錄結果。 

14．去除膜上的探針：將200ml 0.1%SDS（由DEPC 水配制）煮沸后，將膜放入，室溫

下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個(gè)月。 

15．雜交結果  

操作應該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse

酶，以免樣品的降解。轉膜時(shí)，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡