mRNA的分離純化

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mRNA的分離純化

【實(shí)驗原理】

真核生物的mRNA分子是單順?lè )醋?，是編碼蛋白質(zhì)的基因轉錄產(chǎn)物。真核生物的所有蛋白

質(zhì)歸根到底都是 mRNA 的翻譯產(chǎn)物，因此，高質(zhì)量 mRNA 的分離純化是克隆基因、提高

cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動(dòng)物平均每個(gè)細胞含有約1x10-5 g RNA，理論

上認為每克細胞可分離出5～10mg RNA。其中 rRNA為75％～ 85％，tRNA占10％～

16％，而mRNA僅占 1%～5％，并且mRNA分子種類(lèi)繁多，分子量大小不均一，表達豐

度也不一樣。

         真核生物 mRNA 有特征性的結構，即具有 5’端帽子結構（m7G）和 3’端的

poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動(dòng)物細胞的 3’端存在 20~300 個(gè)腺苷酸組成的 poly（A）

尾，通常用 poly（A+）表示，這種結構為真核 mRNA 分子的提取、純化，提供了極為方

便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論

基礎就在于此。

        一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴結構特

性設計的。當總 RNA 流經(jīng)寡聚（dT）（即 oligo(dT)）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，

mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，

經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。

        目前常用的mRNA的純化方法有：

       （1）寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標準方法；

       （2）寡聚（dT）－纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的 

RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA

復合物，再用洗脫液分離mRNA，然后離心除去寡聚（dT）－纖維素；

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        （3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。

         本實(shí)驗應用方法（1）進(jìn)行mRNA的分離純化。

【試劑與器材】

（一）試劑

1． 0.1mol/L NaOH ，每組200mL 

2． 寡聚Oligo（dT）-纖維素

3． 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組 250mL

或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。

4． 洗滌緩沖液 2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組 250mL 或

10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。

        配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒

后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至 65℃時(shí)，加入經(jīng) 65℃溫育（30min）

的10%SDS至終濃度。

5． 5 mol/L NaCl，每組10mL

6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL

7． 無(wú)RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL

8． 70%乙醇，每組10mL

注意：溶液5， 6的配制都應該加0.1% DEPC處理過(guò)夜，溶液1， 3， 4， 8則用經(jīng)0.1% DEPC

處理過(guò)的無(wú)RNase雙蒸水配制，Tris應選用無(wú)RNase的級別。溶液配制后，zui好能夠按一

次實(shí)驗所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實(shí)驗只用一份，避免多次

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操作造成對溶液的污染。

（二）器材

1． 恒溫水浴箱

2． 冷凍高速離心機

3． 紫外分光光度計

4． 巴斯德吸管

5． 玻璃棉

6． 5ml一次性注射器

【操作方法】

（一） oligo(dT)纖維素的預處理

1． 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 

2． 將懸浮液裝入填有經(jīng) DEPC 水處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積

為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無(wú)RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。 

3． 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH 值小于8.0。

4． 將處理好的 oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液 I 懸浮，濃

度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二） 總RNA濃度的調整

1． 把實(shí)驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，

則用無(wú)RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總 RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把

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RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻。

2． 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。

（三） mRNA的分離

1． mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適

量的 oligo(dT)-纖維素到 RNA 樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將 oligo(dT)-纖維素與 RNA

混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。

總RNA

(mg) 

 寡聚Oligo(dT)-纖維素

(mL)

 洗滌緩沖液1，2

(mL)

洗脫體積

(mL) 

<0.2  0.2 1.0   1.0

 0.2-0.5  0.5  1.5  1.5

 0.5-1.0  1.0  3.0  3.0

 1.0-2.0  2.0  5.0  5.0

2． 轉移：取 1 個(gè)5ml 的一次性注射器，取適量經(jīng)過(guò)高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，并把它

固定在無(wú) RNase 的支架上，再把 oligo(dT)-纖維素/RNA 懸浮液轉移到注射器，推進(jìn)塞子

直至底部，把含有未結合上的 RNA 液體排到無(wú) RNase 的離心管中（保留至確定獲得足夠

的mRNA）。

3． 洗滌：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1，溫和振蕩，充分重新懸浮

mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子，用無(wú) RNase 的離心管收集洗出液。測定每一管的

OD260，當洗出液中OD為0時(shí)準備洗脫。

4． 洗脫：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3 倍柱床體積）的洗脫緩沖液 2 或無(wú)

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RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子以1/3至1/2柱床

體積分管收集洗脫液。

5． 測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液組分于4℃，2500g，離心2-3分鐘，

上清轉移至新的離心管中，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。

6． 沉淀：洗脫液中加入 1/10 體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5 倍體積的冰

冷乙醇，混勻后，-20℃30分鐘或放置過(guò)夜。

7． 離心收集：12000g, 4℃離心15 分鐘，小心棄去上清，mRNA沉淀此時(shí)往往看不見(jiàn)，

用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，

或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當體積的無(wú)RNase的雙蒸水，立即用于cDNA

合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。

8． 定量：測定OD260和OD280，計算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率（同上一實(shí)驗）。

【注意事項與提示】

1． 整個(gè)操作過(guò)程必須嚴格遵守無(wú)RNase操作環(huán)境規則。

2． 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質(zhì)量的先決條件。

3． 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，過(guò)量的總RNA，容易造成mRNA不純。

4． RNA 溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱 5 分鐘，這一步很重要，其

作用（1）破壞 mRNA 的二級結構，特別是 poly(A+)尾處的二級結構，使 poly(A+)尾充

分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱后應立即插

入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。

5． 應注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴重影響實(shí)驗結果。

6． mRNA 制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無(wú) DNA 污染。提取的

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mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無(wú)明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb

范圍內（如下圖）。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)一次純化分離的 mRNA 還會(huì )有微量的 rRNA 殘留，但

一般來(lái)說(shuō)不會(huì )對后續實(shí)驗造成很大的影響，如果樣品充足，可將經(jīng)過(guò)一次純化分離的mRNA

再純化一次，進(jìn)一步提高其純度。

圖3.1   mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖

Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;

Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;

Lane 3, 老鼠肝臟mRNA

7． 為防止 mRNA 降解，應避免多次凍融，可將 mRNA 少量分裝后保存。另外，如果有

低溫冰箱,zu好在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。

8． 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并

加入 0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用 NaOH、滅菌 ddH2O、

層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。

9． 一般而言，107哺乳動(dòng)物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA

量的1%-2%。

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【實(shí)驗安排】

1． 一天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase 處理（0.1%DEPC

浸泡或高溫干烤）。

2． 二天：進(jìn)行（一）、（二）和（三）1-6。

3． 三天：進(jìn)行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。

4． 為了避免由于保存時(shí)間過(guò)長(cháng)造成的RNA降解，zui好能將總RNA提取、mRNA的分離

純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實(shí)驗安排在連續的時(shí)間內進(jìn)行。

其他：

引物的設計一般遵循的原則：

1）典型的引物20-24個(gè)核苷長(cháng)。引物需要足夠長(cháng)，保證序列*性，并降低序列存在于非

目的序列位點(diǎn)的可能性。但是太長(cháng)的引物可能會(huì )與錯誤配對序列雜交降低了特異性，同時(shí)因

為 比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

2）設計 5'端和中間區為 G 或 C，且 GC 含量為 50％~60％的引物，以增加引物的穩定性

及其與目的序列雜交的穩定性。

3）3'末端盡量不要富含 GC。設計引物時(shí)保證在zui后 5 個(gè)核苷中含有 3 個(gè) A 或 T。但因為

3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，為了避免3'末端的錯誤配對，所以末端盡量

避免為核苷A。

4）在引物對3'末端盡量避免互補序列以免形成引物二聚體，抑制擴增。如果引物序列可能

產(chǎn)生內部二級結構會(huì )破壞引物退火穩定性，也要盡量避免。

此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物 5'端

而不影響特異性。

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        有時(shí)候，僅有有限的序列信息可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，

可以設計簡(jiǎn)并引物，同時(shí)使用較高的引物濃度（1μM 到 3μM），因為許多簡(jiǎn)并混合物中的

引物不是特異性針對目的模板。

        為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡(jiǎn)

并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的 3'端使用簡(jiǎn)

并堿基，因為3'端zui后3個(gè)堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。