原代細胞的培養與建系 

  凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養的細胞稱(chēng)之為原

代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術(shù)是細胞培養工作的基礎。 

原代細胞的取材 

人和動(dòng)物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。 

一、取材的基本要求 

.1．取材要注意新鮮和保鮮 

.2．應嚴格無(wú)菌 

.3．防止機械損傷 

.4．去除無(wú)用組織和避免干燥 

.5．應注意組織類(lèi)型、分化程度、年齡等 

.6．作好記錄 

二、各類(lèi)組織的取材技術(shù) 

皮膚和粘膜的取材 

內臟和實(shí)體瘤的取材 

血液細胞的取材 

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材 

動(dòng)物組織取材 

人胚體組織取材 

雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材 

皮膚和粘膜的取材 

主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般 2~4 平方厘

米。 

內臟和實(shí)體瘤的取材 

內臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位，實(shí)體瘤取材

時(shí)要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締

組織。 

血液細胞的取材 

血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、

淋巴結等）分離細胞，取材時(shí)應注意抗凝。 

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材 

嚴格無(wú)菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，再用培養液

洗一次后即可培養，不宜低溫存放。 

動(dòng)物組織取材 

1、鼠胚組織取材 

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有 75%酒精的

燒杯中，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(cháng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內，影響組織活

力），取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開(kāi)皮膚，用無(wú)菌

操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，用止血

鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無(wú)菌解剖器材，

采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。 

2、幼鼠胚腎（或肺）取材 

幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側：然

后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側，

然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。 

人胚體組織取材 

取材方法與鼠類(lèi)相同 

雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材步驟 

（1）取孵化至適當胚齡（9~12 天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體

有運動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。 

（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干； 

（3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號鑷子打開(kāi)氣室，沿

氣室邊緣去除蛋殼； 

（4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚； 

（5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材。 

原代細胞的分離和制作 

人或動(dòng)物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁

殖，必須將現有的組織塊充分散開(kāi)，使細胞解離出來(lái)。 

一、懸浮細胞的分離方法 

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，方法是采用 1000r/min 的

低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根

據需要收獲目的細胞。 

二、實(shí)體組織材料的分離方法 

對于實(shí)體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，

可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。 

（一）機械分散法 

方法:.特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少

的軟組織。 

（二）消化分離法 

組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一

步使細胞間的橋連結構松動(dòng)，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機械法，用吸管吹

打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和

大量單個(gè)細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長(cháng)。 

1．酶消化分離法 

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶 

胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴(lài)氨酸或

精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)。 

影響胰蛋白酶作用的主要因素 

細胞類(lèi)型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無(wú)機鹽離子.消化時(shí)間 

膠原酶（Collagenase）消化法 

膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上

皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用。 

2．非酶消化法（EDTA消化法） 

EDTA 是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑或 Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、

鎂離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物

質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或

使貼壁細胞從瓶壁上脫離。 

3．消化分離法的操作步驟 

剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散 

4．消化分離法的注意事項 

（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制

作用。 

（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(cháng)，以避免毒性作用。 

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的

細胞隨漂洗而丟失。 

三、原代細胞的培養方法 

原代細胞的培養也叫初代培養是從供體取得組織細胞在體外進(jìn)行的*培養，是建立細胞系

的起步，是一項基本技術(shù)。 

原代細胞接近和能反映體內生長(cháng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實(shí)驗研究。

（一）組織塊培養法 

組織塊培養是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養方法。 

其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養瓶（或皿）中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以

利于組織塊粘著(zhù)于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長(cháng)。 

（二）消化培養法 

（三）懸浮細胞培養法 

對于懸浮生長(cháng)的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫

細胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養。 

（四）器官培養 

器官培養是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下

培養， 

器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀(guān)察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影

響，以及局部環(huán)境的生物調節作用。 

原代和傳代細胞的培養和維持 

原代細胞的培養與維持 

原代細胞培養的*傳代 

傳代細胞的傳代培養 

傳代細胞的建系和維持 

一、原代細胞的培養與維持 

(一)原代細胞培養： 

1．靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養 

2．懸浮細胞的培養 

靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養要求 

細胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性； 

細胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L； 

培養基可用Eagle(MEM)或DNEM培養； 

小牛血清濃度為10%-80%； 

應在37℃5% CO2的培養箱中培養； 

在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂??； 

待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應將原代細胞換液； 

用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養1周時(shí)，應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液； 

懸浮細胞的培養要求 

原代培養時(shí)要盡量去除紅細胞； 

短期培養，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進(jìn)行； 

細胞濃度可在5-8×109/L范圍內，.進(jìn)行分瓶試驗； 

長(cháng)期培養時(shí)，淋巴細胞中要加入生長(cháng)因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細

胞生長(cháng)； 

細胞換液一般每隔3天需半量換液一次； 

細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行； 

 (二)原代細胞的維持 

貼壁細胞長(cháng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達到飽和密度，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I養成分以滿(mǎn)足

細胞繼續生長(cháng)繁殖的需要； 

換入等量*培養基或換成含2%小牛血清的維持液； 

懸浮細胞細胞培養基中不僅會(huì )發(fā)生轉化而且會(huì )發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養基中的營(yíng)養成分并不

能維持細胞的營(yíng)養需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法； 

二、原代細胞培養的*傳代 

原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞的相互匯合，使整個(gè)瓶

底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長(cháng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養，這種使原代細胞經(jīng)分散接

種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。 

*傳代應注意以下幾點(diǎn)： 

(1)細胞生長(cháng)密度不高時(shí)，不能急于傳代。 

(2)原代培養的貼壁細胞需控制消化時(shí)間。 

(3)吹打已消化的細胞應減少機械損傷。 

(4)*傳代時(shí)細胞接種數量要多一些。 

(5)*傳代培養的pH應偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右 

三、傳代細胞的傳代培養 

傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進(jìn)行細胞傳代。貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代，

部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養

基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進(jìn)行傳代。 

貼壁細胞的消化傳代步驟 

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。 

(2)每瓶加入2mL，無(wú)鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。 

(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動(dòng)培養瓶，經(jīng)

消化液鋪滿(mǎn)所有細胞表面，待細胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀(guān)察到“薄膜”現象時(shí)，倒掉消化液，

再繼續作用2～3分鐘，輕輕搖動(dòng)，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在

顯微鏡下可發(fā)現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時(shí)應立即終止消化。 

(4)加入*培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所

有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的

機械損傷。 

(5)用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。 

四、傳代細胞的建系和維持 

細胞系的維持通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來(lái)實(shí)現； 

對每一個(gè)細胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持必須記錄好細胞檔案,換液傳代

和做好細胞系（或株）的鑒定和管理工作； 

原代細胞的純化和克隆 

體外培養的細胞絕大多數都呈混合生長(cháng)，為了保證實(shí)驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可

重復性，要求采用單一種類(lèi)細胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗，因而培養細胞的純化就成為實(shí)驗研究的重要一

步。 

一、細胞的純化 

細胞的純化分為(一)自然純化：長(cháng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(cháng)慢的細胞，

后來(lái)留下生長(cháng)優(yōu)勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。如腫瘤突變細胞通過(guò)此方法建立細胞系。

(二)人工純化：利用人為手段造成某一細胞生長(cháng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細胞的生長(cháng)從而

達到純化細胞的目的。主要有以下5種方法。 

1．細胞因子依賴(lài)純化法：通過(guò)加入某些特殊的細胞因子而純化出只依賴(lài)于這種細胞因子生

長(cháng)的細胞系。 

2．酶消化法：利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi)，達到純

化的目的。另外對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。 

（1）上皮細胞與成纖維細胞的分離純化 

兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長(cháng)的時(shí)間才脫壁，

特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將

上皮細胞和成纖維細胞分開(kāi)， 

（2）骨髓基質(zhì)肌樣細胞的純化 

在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時(shí)，常有許多肌樣細胞和骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長(cháng)，但也有許

多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上，種類(lèi)混雜，鑒于粘附細胞貼壁不牢固，也可用酶

消化法使粘附細胞脫壁分離，以達到骨髓基質(zhì)細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開(kāi)和純化

的目的。 

3．機械刮除法 

原代培養時(shí),如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長(cháng)，每種細胞都以小片或區域性

分布的方式生長(cháng)在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域，

4．反復貼壁法 

成纖維細胞其貼壁過(guò)程快，能在短時(shí)間內完成附著(zhù)過(guò)程，而上皮細胞在短時(shí)間內不能附著(zhù)或

附著(zhù)不穩定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。 

5．電烙篩選法 

在貼壁細胞轉化時(shí)，在培養瓶的細胞層中會(huì )出現分散的轉化灶，細胞密集、排列規則，有明

顯生長(cháng)趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限，可用機械刮除法去除或用電烙篩選

法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。 

二、細胞的克隆化 

細胞克隆技術(shù)又稱(chēng)單個(gè)細胞分離培養技術(shù)，即從細胞群體中分離出一個(gè)細胞，并使其在體外

培養體系中能繁殖成新的細胞群體，這種由單個(gè)細胞所形成的細胞群（或集落）稱(chēng)為一個(gè)克

隆，這種純化后的細胞群體稱(chēng)為細胞株。 

主要的克隆方法有5種 

（一）毛細管克隆法 

（二）有限稀釋克隆法 

（三）平皿克隆分離法 

（四）軟瓊脂克隆分離法 

（五）單細胞顯微克隆法 

毛細管克隆法： 

（1）將一定量的細胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個(gè)細胞/mL； 

（2）取 10mL 稀釋的細胞懸液，用直徑為 0.5mm，長(cháng)為 8mm 的毛細玻璃管若干（30～

50只），在負壓作用下，使懸液吸入各毛細管中； 

（3）在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細胞的毛細管，然后放入適應性培養基或有飼養層細

胞的培養瓶（或培養板）內； 

（4）在 CO2 培養箱中培養，由一個(gè)細胞在毛細管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個(gè)克

隆的細胞群體。 

有限稀釋克隆法： 

(1)取對數生長(cháng)期的細胞制成懸液(貼壁細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺

盼藍染色計數，測定活細胞數及濃度（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應高于90%以上）。 

（2）將細胞懸液在試管中稀釋?zhuān)门囵B基將細胞稀釋至50個(gè)細胞/mL、10個(gè)細胞/mL、5

個(gè)細胞/mL，將 3種稀釋度的細胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于 37℃5%CO2

下培養。 

（3）次日在倒置顯微鏡下觀(guān)察培養板各孔中的細胞數，挑選只含一個(gè)細胞的孔，做好標記

并補加0.1mL培養液繼續培養。 

（4）培養期間，視pH 值的變化決定是否換液或補加培養液，一周左右，孔中有明顯克隆

出現。 

（5）待克隆長(cháng)至孔底面的1/3～1/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細胞分別移至

24孔板中進(jìn)行擴大培養。 

平皿克隆分離法： 

(1)將對數生長(cháng)期細胞制備單個(gè)細胞懸液（懸浮細胞用吸管吹打分散，貼壁細胞先用 0.25%

胰蛋白酶消化后，再用培養基吹打分散）計數并用培養基調整細胞濃度，使5mL培養液內

含有50～200個(gè)細胞（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應大于90%以上）。 

(2)將上述細胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃5% CO2下培養1周或更長(cháng)。若有明

顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種： 

①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀(guān)察克隆形成的情況，標記單個(gè)克隆周邊，吸干培養基，用涂有

少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán)，套住標記的克隆，在套環(huán)內滴加少量 0.25%胰蛋白酶，待

細胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉入小平皿或24孔板或6 孔板中擴大培養。

②玻片法：在接種細胞懸液前，預先在60mm平皿中放入無(wú)菌小玻片，加入細胞懸液，培

養一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無(wú)菌鑷子取出標記玻片轉

入24孔培養板中繼續培養。 

軟瓊脂克隆分離法： 

(1)將對數生長(cháng)期的細胞制成單個(gè)細胞懸液?jiǎn)蝹€(gè)細胞)作活細胞計數，調整細胞濃度至1×106

細胞/L，然后根據實(shí)驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個(gè)細胞/L為佳。 

(2)制備底層瓊脂取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，

待冷至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入

24孔培養板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。 

(3)制備上層瓊脂取 37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液 9.4mL，移入小燒杯中，加入 50℃

5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養

板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。 

(4)于37℃5% CO2下培養 1~2周或更長(cháng)，若需培養更長(cháng)時(shí)間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培

養液，待有明顯集落形成為止。 

(5)集落（克?。┯嫈翟诘怪蔑@微鏡下觀(guān)察并計數直徑大于 75μm 或含有 50 個(gè)細胞以上的

克隆。 

生成克隆數集落(克隆)形成率(%)= ————————×100% 

每皿接種細胞數    單個(gè)細胞的數目 

單個(gè)細胞百分率(%) = ———————————————×100% 

單個(gè)細胞數目+2 個(gè)以上細胞群數目 

單細胞顯微克隆法： 

是借助顯微操縱器，在顯微鏡監控下將單個(gè)細胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養層細胞的培養板中

進(jìn)行培養克隆的方法。 

（1）飼養層細胞的制備： 

①用 0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(cháng)的 3T3 細胞，調整細胞濃度為 108 細胞/L，在 96

孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于37℃5% CO2中培養至單層。 

②將已形成單層的 3T3 細胞板，用 60Co γ線(xiàn)以 4000～6000 拉得輻射或在培養液中加入

絲裂霉su（終濃度為 10-6mol/L）作用 16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失，但仍可

短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH 而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長(cháng)的

因子。 

(2)制備單個(gè)細胞懸液方法同上。 

(3)分離單個(gè)細胞方法多樣，如： 

①毛細管吸入法同上述毛細管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細胞的毛細管取出。 

②微滴法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加在平皿中

制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細胞的液滴，再用毛細管取出單個(gè)細胞懸滴。 

③液體石蠟法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加入充

滿(mǎn)無(wú)菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細胞液滴，仔細用毛細吸管取出

有一個(gè)細胞的液滴。 

④玻璃小球附著(zhù)法將稀釋至 103 個(gè)細胞/L 的細胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻

璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細胞的玻珠，仔細用鑷

子取出。 

(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細胞，放入預先制備飼養層細胞的96孔培養板中，于37℃

5% CO2下培養1~2周或更長(cháng)。 

(5)待細胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時(shí)，即可將細胞轉種于24孔板進(jìn)行擴大培養

（貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種）。

人或動(dòng)物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密，不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁殖，

即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長(cháng)，若需獲取大量細

胞，必須將現有的組織塊充分散開(kāi)，使細胞解離出來(lái)，常采用的方法如下： 

一、懸浮細胞的分離方法 

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的

低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長(cháng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(cháng)，

以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養基洗一次后，調整

適當細胞濃度后再分瓶培養，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，

經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。

不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細胞分離培養的章節。 

二、實(shí)體組織材料的分離方法 

對于實(shí)體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，

可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。 

(一)機械分散法 

所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織

細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針)，使細胞通過(guò)針頭壓出，或在不銹

鋼紗網(wǎng)內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡(jiǎn)便、快

速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法 

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步

使細胞間的橋連結構松動(dòng)，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機械法，用吸管吹打

分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大

量單個(gè)細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長(cháng)。 

1、酶消化分離法 

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下： 

(1) 胰蛋白酶分散技術(shù) 

胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶)是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，

主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)，在

常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的

作用，取決于細胞類(lèi)型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機鹽離子、pH以及消化

時(shí)間的長(cháng)短等。 

①細胞類(lèi)型 胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊

膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維

肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用，就能增加其對組織的分離作用。 

②酶的活力 市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過(guò)測定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低

溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì )影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有

關(guān)，然后使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時(shí)活力強。 

該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(cháng)，若粉劑結團塊，說(shuō)明

該部分受潮或失效。 

③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)，但遇到難消化

的組織時(shí)，濃度可適當提高，消化時(shí)間適當延長(cháng)。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋

白酶在培養液中可促進(jìn)細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰

蛋白酶因子所清除。 

④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性強，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用

的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。 

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分

散快，細胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細胞時(shí)PH只能選用7.6~8.0之間，否則對細胞有

損傷。 

⑥無(wú)機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類(lèi)溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化

作用。因此，在配制時(shí)應采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。 

⑦消化時(shí)間 如果細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng)，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般

消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃過(guò)夜也可。 

分離方法如下： 

①過(guò)夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks

液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放 4℃過(guò)夜，次日

再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營(yíng)養液吹打分散，細胞計數，

按適當的濃度分瓶培養。 

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種： 

熱消化多次提取--將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后

經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養，然后將留下的未*消化的

組織按上述方法操作，再消化提取細胞。 

冷消化多次提取--方法同上，只是消化溫度為4℃。 

先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散，

制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過(guò)夜，次日再提取細胞，分散成

懸液，分瓶培養。 

(2) 膠原酶(Collagenase)消化法 

膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上

皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠

原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS

和含血清的培養液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細胞成活率，后來(lái)濃度 200u/mL 或

0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和，無(wú)需機械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加

實(shí)驗成本。 

經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未

被*消化開(kāi)。成小團塊的上皮細胞比分散的單個(gè)上皮細胞更易生長(cháng)，因此不必要再進(jìn)一步

消化處理。 

鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見(jiàn)表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)

間(小時(shí))有差異(見(jiàn)表 4-2)，以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還

可加透明質(zhì)酸酶(對細胞表面糖基有作用)，采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、

癌組織非常有效。 

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 

項 目 胰蛋白酶 膠原酶 

消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織 

用 量 0.01%~0.5% 0.1~0.3mg/mL（200u/mL） 

消化時(shí)間  0.5~2小時(shí)（小塊） 1~12小時(shí) 

pH  8~9 6.5~7.0 

作用強度 強烈 緩和 

細胞影響 時(shí)間過(guò)長(cháng)有影響 無(wú)大影響 

血清、鈣、鎂離子 有影響 無(wú)影響 

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5~1cm3) 

酶 種 類(lèi)  

較 硬 組 織 軟 組 織 

4℃ 室 溫 37℃ 4℃ 室 溫 37℃ 

胰蛋白酶（0.25%） 24~48 1~6 1~2 12~24  1~2 0.5~1 

膠原酶（200u/mL）  24 6 6.5 12 3 0.25 

兩者聯(lián)合 12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2 

除上述兩種常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋

白酶，近年來(lái)，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。 

2、非酶消化法(EDTA消化法) 

EDTA是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂

離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)

能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使

貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團塊，常

不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可

降低胰酶的用量和毒性作用。 

消化分離法的操作步驟： 

(1)剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。 

(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜，自然沉

降法)。 

(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA)于 37℃水浴中作用適當時(shí)間(中間可輕搖

1~2 次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松

絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。 

(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。 

(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次

后，加入*培養基。 

(6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或 3~4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后

分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進(jìn)行分瓶培養。 

注意事項如下： 

(1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作

用。 

(2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(cháng)，以避免毒性作用。 

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細

胞隨漂洗而丟失。