<tr id="qe22y"><center id="qe22y"></center></tr>
<sup id="qe22y"><noscript id="qe22y"></noscript></sup>
<object id="qe22y"></object>
<object id="qe22y"></object>
<sup id="qe22y"><noscript id="qe22y"></noscript></sup>
<sup id="qe22y"><wbr id="qe22y"></wbr></sup>
<sup id="qe22y"></sup>
<sup id="qe22y"><wbr id="qe22y"></wbr></sup>
當前位置:首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 原代細胞的培養與建系

原代細胞的培養與建系

更新時(shí)間:2020-03-03瀏覽:2207次

                       原代細胞的培養與建系 

  凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養的細胞稱(chēng)之為原

代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術(shù)是細胞培養工作的基礎。 

原代細胞的取材 

人和動(dòng)物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件,直接影響細胞的體外培養。 

一、取材的基本要求 

.1.取材要注意新鮮和保鮮 

.2.應嚴格無(wú)菌 

.3.防止機械損傷 

.4.去除無(wú)用組織和避免干燥 

.5.應注意組織類(lèi)型、分化程度、年齡等 

.6.作好記錄 

二、各類(lèi)組織的取材技術(shù) 

皮膚和粘膜的取材 

內臟和實(shí)體瘤的取材 

血液細胞的取材 

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材 

動(dòng)物組織取材 

人胚體組織取材 

雞(鴨)鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材雞(鴨)鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材 

皮膚和粘膜的取材 

主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片,方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作,但面積一般 2~4 平方厘

米。 

內臟和實(shí)體瘤的取材 

內臟除消化道外基本是無(wú)菌的,但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位,實(shí)體瘤取材

時(shí)要取腫瘤細胞豐富的區域,要避開(kāi)破潰、壞死液化部分,以防污染,盡量去除混雜的結締

組織。 

血液細胞的取材 

血細胞、淋巴細胞的取材,一般多抽取靜脈外周血,或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、

淋巴結等)分離細胞,取材時(shí)應注意抗凝。 

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材 

嚴格無(wú)菌,注意抗凝,還要盡快分離培養,離心后,用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次,再用培養液

洗一次后即可培養,不宜低溫存放。 

動(dòng)物組織取材 

1、鼠胚組織取材 

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物,然后將其整個(gè)浸泡在含有 75%酒精的

燒杯中,5分鐘后(注意時(shí)間不能太長(cháng),以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內,影響組織活

力),取出動(dòng)物,在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢,切開(kāi)皮膚,用無(wú)菌

操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚,用止血

鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾,把動(dòng)物反包,暴露軀干,然后再固定,更換無(wú)菌解剖器材,

采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。 

2、幼鼠胚腎(或肺)取材 

幼鼠采用上述方法處死消毒后,腹部朝上固定在木板上,先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側:然

后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺,或背部朝上固定在木板上,先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側,

然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。 

人胚體組織取材 

取材方法與鼠類(lèi)相同 

雞(鴨)鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材步驟 

1)取孵化至適當胚齡(9~12 天)的胚蛋,用照蛋燈在暗處燈檢,若有豐富血管、胚體

有運動(dòng)的胚蛋,說(shuō)明胚體發(fā)育良好,并用有色筆劃出氣室和胚體位置。 

2)將胚蛋置于蛋架上,先用溫水清洗蛋殼,再用75%酒精棉球擦干; 

3)經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后,在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號鑷子打開(kāi)氣室,沿

氣室邊緣去除蛋殼; 

4)用眼科鑷撕去殼膜,暴露出雞胚; 

5)用彎頭鑷輕挑起胚頭,取出胚胎,放入無(wú)菌平皿中,解剖取材。 

 

原代細胞的分離和制作 

人或動(dòng)物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密,不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁

殖,必須將現有的組織塊充分散開(kāi),使細胞解離出來(lái)。 

一、懸浮細胞的分離方法 

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,方法是采用 1000r/min

低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根

據需要收獲目的細胞。 

二、實(shí)體組織材料的分離方法 

對于實(shí)體組織材料,由于細胞間結合緊密,為了使組織中的細胞充分分散,形成細胞懸液,

可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。 

(一)機械分散法 

方法:.特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對組織機械損傷大,而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少

的軟組織。 

(二)消化分離法 

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀),應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一

步使細胞間的橋連結構松動(dòng),使團塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機械法,用吸管吹

打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細胞團塊得以較充分的分散,制成少量細胞群團和

大量單個(gè)細胞的細胞懸液,接種培養后,細胞容易貼壁生長(cháng)。 

1.酶消化分離法 

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶 

胰蛋白酶分散原理:胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴(lài)氨酸或

精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)。 

影響胰蛋白酶作用的主要因素 

細胞類(lèi)型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無(wú)機鹽離子.消化時(shí)間 

膠原酶(Collagenase)消化法 

膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶,對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上

皮組織以及癌組織,它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用。 

2.非酶消化法(EDTA消化法) 

EDTA 是一種非酶消化物,又稱(chēng)螯合劑或 Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、

鎂離子的 PBS 配成 0.02%的工作液,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物

質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物,利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或

使貼壁細胞從瓶壁上脫離。 

3.消化分離法的操作步驟 

剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散 

4.消化分離法的注意事項 

1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制

作用。 

2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高,作用時(shí)間不能太長(cháng),以避免毒性作用。 

3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動(dòng)作要輕,以避免膨松的

細胞隨漂洗而丟失。 

三、原代細胞的培養方法 

原代細胞的培養也叫初代培養是從供體取得組織細胞在體外進(jìn)行的*培養,是建立細胞系

的起步,是一項基本技術(shù)。 

原代細胞接近和能反映體內生長(cháng)特性,適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實(shí)驗研究。

 

(一)組織塊培養法 

組織塊培養是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養方法。 

其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養瓶(或皿)中,瓶壁可預先涂以膠原薄層,以

利于組織塊粘著(zhù)于瓶壁,使周邊細胞能沿瓶壁向外生長(cháng)。 

(二)消化培養法 

(三)懸浮細胞培養法 

對于懸浮生長(cháng)的細胞,如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫

細胞無(wú)需消化,可采用低速離心分離,直接培養,或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養。 

(四)器官培養 

器官培養是指從供體取得器官或組織塊后,不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下

培養, 

器官培養可保持器官組織的相對完整性,可用于重點(diǎn)觀(guān)察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影

響,以及局部環(huán)境的生物調節作用。 

原代和傳代細胞的培養和維持 

原代細胞的培養與維持 

原代細胞培養的*傳代 

傳代細胞的傳代培養 

傳代細胞的建系和維持 

一、原代細胞的培養與維持 

()原代細胞培養: 

1.靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養 

2.懸浮細胞的培養 

靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養要求 

細胞要通過(guò)充分漂洗,以盡量除去消化液的毒性; 

細胞接種時(shí)濃度要稍大一些,至少為5×108細胞/L; 

培養基可用Eagle(MEM)DNEM培養; 

小牛血清濃度為10%-80%; 

應在375% CO2的培養箱中培養; 

在起始的2天中盡量減少振蕩,以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落,漂??; 

待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀,應將原代細胞換液; 

用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養1周時(shí),應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液; 

懸浮細胞的培養要求 

原代培養時(shí)要盡量去除紅細胞; 

短期培養,可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進(jìn)行; 

細胞濃度可在5-8×109/L范圍內,.進(jìn)行分瓶試驗; 

長(cháng)期培養時(shí),淋巴細胞中要加入生長(cháng)因子,白血病細胞中要加入少量的原患者血清,以利細

胞生長(cháng); 

細胞換液一般每隔3天需半量換液一次; 

細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行; 

 ()原代細胞的維持 

貼壁細胞長(cháng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí),未達到飽和密度,需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I養成分以滿(mǎn)足

細胞繼續生長(cháng)繁殖的需要; 

換入等量*培養基或換成含2%小牛血清的維持液; 

懸浮細胞細胞培養基中不僅會(huì )發(fā)生轉化而且會(huì )發(fā)生分裂繁殖,此時(shí)培養基中的營(yíng)養成分并不

能維持細胞的營(yíng)養需求,需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法; 

二、原代細胞培養的*傳代 

原代培養后由于懸浮細胞增殖,數量增加甚至達飽和密度;貼壁細胞的相互匯合,使整個(gè)瓶

底逐漸被細胞覆蓋,細胞難以繼續生長(cháng)繁殖,需要進(jìn)行分瓶培養,這種使原代細胞經(jīng)分散接

種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。 

*傳代應注意以下幾點(diǎn): 

(1)細胞生長(cháng)密度不高時(shí),不能急于傳代。 

(2)原代培養的貼壁細胞需控制消化時(shí)間。 

(3)吹打已消化的細胞應減少機械損傷。 

(4)*傳代時(shí)細胞接種數量要多一些。 

(5)*傳代培養的pH應偏低些。小牛血清濃度可加大至15%20%左右 

三、傳代細胞的傳代培養 

傳代細胞,可根據不同細胞采取不同的方法進(jìn)行細胞傳代。貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代,

部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養

基后直接吹打分散進(jìn)行傳代,或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進(jìn)行傳代。 

貼壁細胞的消化傳代步驟 

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基(以25mL培養瓶為例)。 

(2)每瓶加入2mL,無(wú)鈣、鎂PBS,漂洗一次后倒掉。 

(3)每瓶加入1mL消化液(0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液),輕輕搖動(dòng)培養瓶,經(jīng)

消化液鋪滿(mǎn)所有細胞表面,待細胞層略有松動(dòng),肉眼可觀(guān)察到薄膜現象時(shí),倒掉消化液,

再繼續作用23分鐘,輕輕搖動(dòng),細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái),在

顯微鏡下可發(fā)現細胞回縮變圓,細胞間隙增大,此時(shí)應立即終止消化。 

(4)加入*培養基5mL,用吸管反復吹打瓶壁上的細胞,吹打時(shí)要按順序進(jìn)行,以確保所

有瓶壁均吹打到,吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,不要用力過(guò)大,盡可能不要出現泡沫,以避免細胞的

機械損傷。 

(5)用計數板計數,計算細胞的濃度,并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。 

四、傳代細胞的建系和維持 

細胞系的維持通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來(lái)實(shí)現; 

對每一個(gè)細胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn),要做好建系的維持必須記錄好細胞檔案,換液傳代

和做好細胞系(或株)的鑒定和管理工作; 

原代細胞的純化和克隆 

體外培養的細胞絕大多數都呈混合生長(cháng),為了保證實(shí)驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可

重復性,要求采用單一種類(lèi)細胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗,因而培養細胞的純化就成為實(shí)驗研究的重要一

步。 

一、細胞的純化 

細胞的純化分為()自然純化:長(cháng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法,不斷排擠其他生長(cháng)慢的細胞,

后來(lái)留下生長(cháng)優(yōu)勢旺的細胞,達到細胞純化的目的。如腫瘤突變細胞通過(guò)此方法建立細胞系。

()人工純化:利用人為手段造成某一細胞生長(cháng)有利的環(huán)境條件,抑制其他細胞的生長(cháng)從而

達到純化細胞的目的。主要有以下5種方法。 

1.細胞因子依賴(lài)純化法:通過(guò)加入某些特殊的細胞因子而純化出只依賴(lài)于這種細胞因子生

長(cháng)的細胞系。 

2.酶消化法:利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,使兩者分開(kāi),達到純

化的目的。另外對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。 

1)上皮細胞與成纖維細胞的分離純化 

兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細胞先脫壁,而上皮細胞要消化相當長(cháng)的時(shí)間才脫壁,

特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將

上皮細胞和成纖維細胞分開(kāi), 

2)骨髓基質(zhì)肌樣細胞的純化 

在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時(shí),常有許多肌樣細胞和骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長(cháng),但也有許

多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上,種類(lèi)混雜,鑒于粘附細胞貼壁不牢固,也可用酶

消化法使粘附細胞脫壁分離,以達到骨髓基質(zhì)細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開(kāi)和純化

的目的。 

3.機械刮除法 

原代培養時(shí),如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長(cháng),每種細胞都以小片或區域性

分布的方式生長(cháng)在瓶壁上??刹捎脵C械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域,

 

4.反復貼壁法 

成纖維細胞其貼壁過(guò)程快,能在短時(shí)間內完成附著(zhù)過(guò)程,而上皮細胞在短時(shí)間內不能附著(zhù)或

附著(zhù)不穩定,稍加振蕩即浮起,利用此差別可以純化細胞。 

5.電烙篩選法 

在貼壁細胞轉化時(shí),在培養瓶的細胞層中會(huì )出現分散的轉化灶,細胞密集、排列規則,有明

顯生長(cháng)趨勢,與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限,可用機械刮除法去除或用電烙篩選

法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。 

二、細胞的克隆化 

細胞克隆技術(shù)又稱(chēng)單個(gè)細胞分離培養技術(shù),即從細胞群體中分離出一個(gè)細胞,并使其在體外

培養體系中能繁殖成新的細胞群體,這種由單個(gè)細胞所形成的細胞群(或集落)稱(chēng)為一個(gè)克

隆,這種純化后的細胞群體稱(chēng)為細胞株。 

主要的克隆方法有5 

(一)毛細管克隆法 

(二)有限稀釋克隆法 

(三)平皿克隆分離法 

(四)軟瓊脂克隆分離法 

(五)單細胞顯微克隆法 

毛細管克隆法: 

1)將一定量的細胞懸液(如105/mL或更低)稀釋至1個(gè)細胞/mL; 

2)取 10mL 稀釋的細胞懸液,用直徑為 0.5mm,長(cháng)為 8mm 的毛細玻璃管若干(30

50只),在負壓作用下,使懸液吸入各毛細管中; 

3)在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細胞的毛細管,然后放入適應性培養基或有飼養層細

胞的培養瓶(或培養板)內; 

4)在 CO2 培養箱中培養,由一個(gè)細胞在毛細管繁殖后,并向管外擴展,并形成單個(gè)克

隆的細胞群體。 

有限稀釋克隆法: 

(1)取對數生長(cháng)期的細胞制成懸液(貼壁細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成),經(jīng)臺

盼藍染色計數,測定活細胞數及濃度(細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應高于90%以上)。 

2)將細胞懸液在試管中稀釋?zhuān)门囵B基將細胞稀釋至50個(gè)細胞/mL、10個(gè)細胞/mL、5

個(gè)細胞/mL,將 3種稀釋度的細胞分別接種于96孔板中,每孔為0.1mL,于 375%CO2

下培養。 

3)次日在倒置顯微鏡下觀(guān)察培養板各孔中的細胞數,挑選只含一個(gè)細胞的孔,做好標記

并補加0.1mL培養液繼續培養。 

4)培養期間,視pH 值的變化決定是否換液或補加培養液,一周左右,孔中有明顯克隆

出現。 

5)待克隆長(cháng)至孔底面的1/31/2時(shí),可用消化法將96孔中的單一克隆的細胞分別移至

24孔板中進(jìn)行擴大培養。 

平皿克隆分離法: 

(1)將對數生長(cháng)期細胞制備單個(gè)細胞懸液(懸浮細胞用吸管吹打分散,貼壁細胞先用 0.25%

胰蛋白酶消化后,再用培養基吹打分散)計數并用培養基調整細胞濃度,使5mL培養液內

含有50200個(gè)細胞(細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應大于90%以上)。 

(2)將上述細胞懸液迅速移入60mm平皿中,在375% CO2下培養1周或更長(cháng)。若有明

顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離,方法有兩種: 

套環(huán)法:在倒置顯微鏡下觀(guān)察克隆形成的情況,標記單個(gè)克隆周邊,吸干培養基,用涂有

少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán),套住標記的克隆,在套環(huán)內滴加少量 0.25%胰蛋白酶,待

細胞脫離時(shí),用注射器針頭輕輕吹打分散后,轉入小平皿或24孔板或6 孔板中擴大培養。

 

玻片法:在接種細胞懸液前,預先在60mm平皿中放入無(wú)菌小玻片,加入細胞懸液,培

養一定時(shí)間后,在倒置顯微鏡下標記上含一個(gè)克隆的玻片,然后用無(wú)菌鑷子取出標記玻片轉

24孔培養板中繼續培養。 

軟瓊脂克隆分離法: 

(1)將對數生長(cháng)期的細胞制成單個(gè)細胞懸液?jiǎn)蝹€(gè)細胞)作活細胞計數,調整細胞濃度至1×106

細胞/L,然后根據實(shí)驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個(gè)細胞/L為佳。 

(2)制備底層瓊脂取5%瓊脂置沸水中,使瓊脂*溶化,取出一份5%瓊脂,移入小燒杯中,

待冷至50,迅速加入9份預溫37的新鮮培養液(即成為0.5%瓊脂),混勻后立即注入

24孔培養板中,每孔含0.5% 瓊脂0.8mL,置室溫使瓊脂凝固備用(此層也可以省略)。 

(3)制備上層瓊脂取 37保溫的、不同濃度的細胞懸液 9.4mL,移入小燒杯中,加入 50

5% 瓊脂0.6mL迅速混勻,即配成0.3%瓊脂培養基,立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養

板中,每孔0.8ml,置室溫使瓊脂凝固。 

(4)375% CO2下培養 1~2周或更長(cháng),若需培養更長(cháng)時(shí)間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培

養液,待有明顯集落形成為止。 

(5)集落(克?。┯嫈翟诘怪蔑@微鏡下觀(guān)察并計數直徑大于 75μm 或含有 50 個(gè)細胞以上的

克隆。 

生成克隆數集落(克隆)形成率(%)= ————————×100% 

每皿接種細胞數    單個(gè)細胞的數目 

單個(gè)細胞百分率(%) = ———————————————×100% 

單個(gè)細胞數目+2 個(gè)以上細胞群數目 

單細胞顯微克隆法: 

是借助顯微操縱器,在顯微鏡監控下將單個(gè)細胞逐個(gè)吸出,移入含有飼養層細胞的培養板中

進(jìn)行培養克隆的方法。 

1)飼養層細胞的制備: 

0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(cháng)的 3T3 細胞,調整細胞濃度為 108 細胞/L,在 96

孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于375% CO2中培養至單層。 

將已形成單層的 3T3 細胞板,用 60Co γ線(xiàn)以 40006000 拉得輻射或在培養液中加入

絲裂霉su(終濃度為 10-6mol/L)作用 16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失,但仍可

短期存活,有代謝功能,不僅可維持pH 而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長(cháng)的

因子。 

(2)制備單個(gè)細胞懸液方法同上。 

(3)分離單個(gè)細胞方法多樣,如: 

毛細管吸入法同上述毛細管法,在顯微鏡下將只有一個(gè)細胞的毛細管取出。 

微滴法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液,用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加在平皿中

制成散滴,在顯微鏡下挑選出單個(gè)細胞的液滴,再用毛細管取出單個(gè)細胞懸滴。 

液體石蠟法將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液,用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加入充

滿(mǎn)無(wú)菌液體石蠟的平皿底部,在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細胞液滴,仔細用毛細吸管取出

有一個(gè)細胞的液滴。 

玻璃小球附著(zhù)法將稀釋至 103 個(gè)細胞/L 的細胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻

璃珠的平皿中,混勻后,在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細胞的玻珠,仔細用鑷

子取出。 

(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細胞,放入預先制備飼養層細胞的96孔培養板中,于37

5% CO2下培養1~2周或更長(cháng)。 

(5)待細胞克隆明顯,并使孔底覆蓋1/31/2時(shí),即可將細胞轉種于24孔板進(jìn)行擴大培養

(貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種)。

人或動(dòng)物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密,不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁殖,

即使采用1mm3的組織塊,也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長(cháng),若需獲取大量細

胞,必須將現有的組織塊充分散開(kāi),使細胞解離出來(lái),常采用的方法如下: 

一、懸浮細胞的分離方法 

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min

低速離心10分鐘,若懸液量大,可適當延長(cháng)離心時(shí)間,但速度不能太高,延時(shí)也不能太長(cháng),

以避免擠壓或機械損傷細胞,離心沉淀用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次,用培養基洗一次后,調整

適當細胞濃度后再分瓶培養,若選用懸液中某些細胞,常采用離心后的細胞分層液,因為,

經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據需要收獲目的細胞。

不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細胞分離培養的章節。 

二、實(shí)體組織材料的分離方法 

對于實(shí)體組織材料,由于細胞間結合緊密,為了使組織中的細胞充分分散,形成細胞懸液,

可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。 

()機械分散法 

所取材料若纖維成分很少,如腦組織,部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織

細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針),使細胞通過(guò)針頭壓出,或在不銹

鋼紗網(wǎng)內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡(jiǎn)便、快

速,但對組織機械損傷大,而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

 

()消化分離法 

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀),應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步

使細胞間的橋連結構松動(dòng),使團塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機械法,用吸管吹打

分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細胞團塊得以較充分的分散,制成少量細胞群團和大

量單個(gè)細胞的細胞懸液,接種培養后,細胞容易貼壁生長(cháng)。 

1、酶消化分離法 

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶,其分離方法如下: 

(1) 胰蛋白酶分散技術(shù) 

胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶)是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質(zhì)有水介作用,

主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi),在

常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的

作用,取決于細胞類(lèi)型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機鹽離子、pH以及消化

時(shí)間的長(cháng)短等。 

細胞類(lèi)型 胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊

膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維

肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效,但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。 

酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過(guò)測定而有效,但配制時(shí)必須新鮮,需保存在低

溫冰箱中,消化時(shí)的pH和溫度都要適宜,否則會(huì )影響活力,細胞的分散直接與酶的活力有

關(guān),然后使用活力為1:2001:250,56pH8.0時(shí)活力強。 

該酶為粉劑,保藏時(shí)要防潮,室內溫度不宜過(guò)高,保存時(shí)間不能太長(cháng),若粉劑結團塊,說(shuō)明

該部分受潮或失效。 

酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:2001:250),但遇到難消化

的組織時(shí),濃度可適當提高,消化時(shí)間適當延長(cháng)。濃度高對細胞有毒性,而較低濃度的胰蛋

白酶在培養液中可促進(jìn)細胞的增殖,若培養液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰

蛋白酶因子所清除。 

溫度 一般認為胰蛋白酶在56時(shí)活性強,但由于對細胞有損害而不能被采用,常使用

的溫度為37,通常在37進(jìn)行消化比室溫作用快。 

pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強分

散快,細胞也容易被消化下來(lái),消化分離細胞時(shí)PH只能選用7.6~8.0之間,否則對細胞有

損傷。 

無(wú)機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類(lèi)溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí),可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化

作用。因此,在配制時(shí)應采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。 

消化時(shí)間 如果細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng),可以損害細胞的呼吸酶,從而影響細胞的代謝,一般

消化時(shí)間為20分鐘為宜,冷消化時(shí)使用低濃度消化液,于4過(guò)夜也可。 

分離方法如下: 

過(guò)夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次,剪成碎塊大小為 4 毫米左右,用 Hanks

液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織,再加入 0.25%的胰蛋白酶,搖勻后放 4過(guò)夜,次日

再用Hanks液洗滌,棄去上清,共洗2~3次,然后,加入少量營(yíng)養液吹打分散,細胞計數,

按適當的濃度分瓶培養。 

多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種: 

熱消化多次提取--將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37水浴中消化15~20分鐘,然后

經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散制成細胞懸液,按合適的濃度分瓶培養,然后將留下的未*消化的

組織按上述方法操作,再消化提取細胞。 

冷消化多次提取--方法同上,只是消化溫度為4。 

先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于 37下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散,

制成懸液,剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4下過(guò)夜,次日再提取細胞,分散成

懸液,分瓶培養。 

(2) 膠原酶(Collagenase)消化法 

膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶,對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上

皮組織以及癌組織,它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠

原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用 PBS

和含血清的培養液配制,即操作簡(jiǎn)便又可提高細胞成活率,后來(lái)濃度 200u/mL

0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無(wú)需機械振蕩,但膠原酶價(jià)格較高,大量使用將增加

實(shí)驗成本。 

經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細胞對酶有耐受性,可能有一些上皮細胞團塊尚未

被*消化開(kāi)。成小團塊的上皮細胞比分散的單個(gè)上皮細胞更易生長(cháng),因此不必要再進(jìn)一步

消化處理。 

鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見(jiàn)表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)

(小時(shí))有差異(見(jiàn)表 4-2),以及兩者價(jià)格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時(shí)還

可加透明質(zhì)酸酶(對細胞表面糖基有作用),采用兩者的聯(lián)合消化作用,對分散大鼠和兔肝、

癌組織非常有效。 

4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 

胰蛋白酶 膠原酶 

消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織 

0.01%~0.5% 0.1~0.3mg/mL200u/mL 

消化時(shí)間  0.5~2小時(shí)(小塊) 1~12小時(shí) 

pH  8~9 6.5~7.0 

作用強度 強烈 緩和 

細胞影響 時(shí)間過(guò)長(cháng)有影響 無(wú)大影響 

血清、鈣、鎂離子 有影響 無(wú)影響 

4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5~1cm3) 

類(lèi)  

 

4 37 4 37 

胰蛋白酶(0.25% 24~48 1~6 1~2 12~24  1~2 0.5~1 

膠原酶(200u/mL  24 6 6.5 12 3 0.25 

兩者聯(lián)合 12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2 

除上述兩種常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋

白酶,近年來(lái),還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。 

2、非酶消化法(EDTA消化法

EDTA是一種非酶消化物,又稱(chēng)螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂

離子的 PBS 配成 0.02%的工作液,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)

能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物,利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使

貼壁細胞從瓶壁上脫離,缺點(diǎn)是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀,有團塊,常

不單獨使用,但可與胰蛋白酶混合使用(1:12:1),不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散,可

降低胰酶的用量和毒性作用。 

消化分離法的操作步驟: 

(1)剪切 把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。 

(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無(wú)鈣鎂PBS2-3(采用傾斜,自然沉

降法)。 

(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA) 37水浴中作用適當時(shí)間(中間可輕搖

1~2 ),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續消化直至膨松

絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。 

(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。 

(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應,采用漂洗法洗2-3

后,加入*培養基。 

(6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法,使細胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或 3~4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后

分瓶培養,若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細胞懸液進(jìn)行分瓶培養。 

注意事項如下: 

(1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作

用。 

(2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高,作用時(shí)間不能太長(cháng),以避免毒性作用。 

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動(dòng)作要輕,以避免膨松的細

胞隨漂洗而丟失。 

 

 

Contact Us
  • 聯(lián)系QQ:185271790
  • 聯(lián)系郵箱:cbzzh188188@qq.com
  • 聯(lián)系電話(huà):18818844207
  • 聯(lián)系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯(lián)8立方創(chuàng )意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢(xún)

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:粵ICP備19162636號

技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    管理登陸    GoogleSitemap

服務(wù)熱線(xiàn)
020-86438890

微信服務(wù)號

<tr id="qe22y"><center id="qe22y"></center></tr>
<sup id="qe22y"><noscript id="qe22y"></noscript></sup>
<object id="qe22y"></object>
<object id="qe22y"></object>
<sup id="qe22y"><noscript id="qe22y"></noscript></sup>
<sup id="qe22y"><wbr id="qe22y"></wbr></sup>
<sup id="qe22y"></sup>
<sup id="qe22y"><wbr id="qe22y"></wbr></sup>
都匀市| 华宁县| 临猗县| 崇明县| 卓资县| 山阳县| 通山县| 林周县| 通许县| 玉树县| 合江县| 伊春市| 永寿县| 大石桥市| 西华县| 铅山县| 霍州市| 永吉县| 堆龙德庆县| 崇明县| 西充县| 山西省| 林甸县| 红原县| 绥江县| 施秉县| 河东区| 忻城县| 上饶县| 民丰县| 凤台县| 綦江县| 泉州市| 明溪县| 苍梧县| 腾冲县| 连平县| 遂平县| 凉城县| 大姚县| 通辽市| http://444 http://444 http://444 http://444 http://444 http://444