原代細胞培養和傳代培養的方法 

原代培養 

原理  

    將動(dòng)物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）

或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長(cháng)和繁殖，

這一過(guò)程稱(chēng)原代培養。      

儀器、材料及試劑  

    儀器：培養箱（調整至37℃），培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液

管、紗布、手術(shù)器械、血球計數板、離心機、水浴箱（37℃）  

    材料：動(dòng)物組織塊  

    試劑：1640培養基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 

初代消化培養法 

1. 準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線(xiàn)消毒20分鐘。開(kāi)始工作前先洗

手、75%酒精擦拭手至肘部。 

2. 布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。 

3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗 2~3次，去除血污；如懷疑組織可

能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。 

4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多

30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。 

5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動(dòng)一次，如

用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。 

6. 分離：在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀(guān)察，如組織

已分散成細胞團或單個(gè)細胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化

開(kāi)的組織塊。低速（500~1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血

清的培養液。 

7. 計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過(guò)大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶

中。對大多數細胞來(lái)說(shuō)，pH 要求在7.2~7.4 范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)明

液體變酸，可用NaHCO3調整。 

8. 培養：置于36.5℃溫箱培養，如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，

紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需要換新塞。 

初代組織塊培養法 

1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血

污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。 

2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶

底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養瓶底可擺布20~30塊。 

3. 輕輕翻轉培養瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時(shí)勿另組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置36.5℃

溫箱培養2小時(shí)左右（勿超過(guò)4小時(shí)），使小塊微干涸。 

4. 培養：從微箱中取出培養瓶，開(kāi)塞，46度斜持培養瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養液少

許，然后緩緩再把培養瓶翻轉過(guò)來(lái)，讓培養液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中

靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。 

傳代培養法 

原理  

    細胞在培養瓶長(cháng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長(cháng)，同時(shí) 

也將細胞數量擴大，就必須進(jìn)行傳代（再培養）。 傳代培養也是一種將細胞種保存下去

的方法。同時(shí)也是利用培養細胞進(jìn)行各種實(shí)驗的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，

而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。 

材料和試劑  

1. 細胞：貼壁細胞株  

2. 試劑：0.25％胰酶、1640培養基（含10％小牛血清）  

3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等 

   操作步驟 

1. 吸除培養瓶?jì)扰f培養液。 

2. 向瓶?jì)燃尤胍鹊鞍酌负虴DTA混合液少許，以能覆滿(mǎn)瓶底為限。 

3. 置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。 

4. 吸除消化液，向瓶?jì)茸⑷際anks液數毫升，輕輕轉動(dòng)培養瓶，把殘余消化液沖掉。注

意加Hanks液沖洗細胞時(shí)，動(dòng)作要輕，以免把已松動(dòng)的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液?jiǎn)?/span>

獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養液。 

5. 用吸管吸取營(yíng)養液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。 

6. 計數板計數后，把細胞懸液分成等份分裝入數個(gè)培養瓶中，置溫箱中培養。 

無(wú)菌操作注意事項  

1. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要

擦試。  

2. 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間

不能太長(cháng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過(guò)營(yíng)養液的用具不能再燒灼，以免燒

焦形成碳膜。  

3. 操作動(dòng)作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機會(huì )。  

4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。  

5. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45℃斜位。  

6. 吸溶液的吸管等不能混用。