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實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體實(shí)驗步驟
1 樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯f(wàn)ang,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈
振蕩管體15秒后,15 到30℃孵育2 到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后
混合液體將分為下層的紅色酚氯f(wàn)ang相,中間層以及無(wú)色水相上層。RNA 全部被分配于水相
中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀
其中的 RNA,混勻后15 到 30℃孵育 10 分鐘后,于 4℃下 12000rpm 離心 10 分鐘。此
時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA 清洗 移去上清液,每 1mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1ml 的 75%乙醇
(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時(shí),先加入無(wú) RNA 酶的水 40μl 用槍反復吹打幾次,使其完
全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測
1)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量 RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100)后,
讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示 40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋
倍數× 40 µg/ml。具體計算如下:
RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495µl的TE中,測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul用來(lái)測量以后,剩余樣品RNA為35 µl,剩余 RNA總量為:
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37%
甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽
內,加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
②準備RNA樣品
取3µgRNA,加 3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。
加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭
指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀(guān)察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型),上
面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴散的帶,它由
低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到
一片彌散的 EB 染色物質(zhì),可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過(guò)程中如果
出現DNA污染,將會(huì )在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或
者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
3樣品cDNA合成
①反應體系
序號 反應物 劑量
1 逆轉錄buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 總體積 10μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘,取出后立即冰水浴至管內外溫
度一致,然后加逆轉錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。
③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。
4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR
①β-actin 陽(yáng)性模板的標準梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為 1011,反應前取 3μl 按 10 倍稀釋
(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
②反應體系如下:
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl
3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽(yáng)性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系:
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內參照上游引物F 0.5μl
3 內參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
③制備好的陽(yáng)性標準品和檢測樣本同時(shí)上機,反應條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分
鐘,55℃ 2分鐘,共40個(gè)循環(huán)。
5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線(xiàn)的DNA模板
①針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應。
反應體系:
序號 反應物 劑量
1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25ul
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72ºC延伸5分鐘。
②PCR 產(chǎn)物與 DNA Ladder 在 2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測 PCR 產(chǎn)物是否
為單一特異性擴增條帶。
③將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 10 倍梯度稀釋: 將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 10 倍梯度稀釋: 設定 PCR 產(chǎn)物濃度
為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。
6 待測樣品的待測基因實(shí)時(shí)定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應體系。
體系配置如下:
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴增反應。反應條件為:93℃
2分鐘預變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個(gè)循環(huán),后72℃
7分鐘延伸。
7 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
引物設計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物
與引物之間避免形成穩定的二聚體或發(fā)夾結構;引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合
反應(即錯配)。
8 電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在
2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView™染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
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