服務(wù)熱線(xiàn)
020-86438890
摘要:細胞增殖是生物體的重要生命特征,細胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。研究細胞增殖,對于理解細胞發(fā)育和分化,探索腫瘤發(fā)生和治療,以及評估細胞健康狀況和藥物安全性評價(jià)等都具有重要意義。在檢測細胞增殖的多種方法中,直接測定DNA合成是一種敏感并高精度的分析方法。5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine,BrdU),是一種胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物。當細胞處于細胞周期中的DNA合成期 (S期) 時(shí),BrdU可以摻入到新合成的DNA中。利用抗BrdU的單克隆抗體熒光染色,就可通過(guò)流式細胞術(shù)檢測BrdU的含量,從而定量細胞群體的增殖情況 (Davies和Allen, 2007)。另外,結合核酸染料測定單個(gè)細胞的DNA含量,還可以定性特定細胞在細胞周期中的具體進(jìn)程。該實(shí)驗方案中,運用脫氧核糖核酸酶DNase I消化解開(kāi)DNA雙鏈,使抗體與DNA鏈上的BrdU得以接近和結合。與傳統的醇固定和強酸變性處理的方法相比,該方案更溫和,可同時(shí)對細胞表面及胞內的其他標記物進(jìn)行多色流式分析。
關(guān)鍵詞: 細胞增殖檢測, 細胞周期, 5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine,BrdU), 脫氧核糖核酸酶DNase I, 流式細胞術(shù)
材料與試劑
1. 15 ml離心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)
2. 12 × 75 mm的5 ml聚苯乙烯流式管 (BD Falcon, catalog number: 352008)
3. 200目過(guò)濾尼龍網(wǎng)
4. 0.22 μm濾器 (Pall, catalog number: 4612)
5. HeLa細胞
6. 脫氧核糖核酸酶DNase I (Promega, catalog number: M6101)
7. 胎牛血清FBS (杭州四季青)
8. 小鼠抗BrdU單克隆抗體,克隆號Bu20a (Cell Signaling Technology, catalog number: 5292)
9. Alexa FluorTM488標記的山羊抗小鼠IgG二抗 (Invitrogen, catalog number: A11001)
儀器設備
1. -80 °C冰箱 (Thermo, model: 905)
2. 二氧化碳培養箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)
3. 旋渦混勻器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)
4. 水浴鍋 (精宏, model: DK-80)
5. 恒溫磁力攪拌器 (虹浦, model: 85-2型)
6. 電子天平 (METTLER-TOLEDO, model: PB602-S)
7. pH計 (METTLER-TOLEDO, model: FE-20)
8. 臺式冷凍離心機 (Eppendorf, model: 5810R,配A-4-62水平轉子)
9. 流式細胞分析儀 (BD LSRFortessa,配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)
軟件
1. FlowJo軟件
實(shí)驗步驟
1. BrdU摻入
處于對數生長(cháng)期的HeLa細胞,培液中加入終濃度10 μM的BrdU,5% CO2培養箱中繼續在37 °C下避光培養60分鐘。同時(shí),培養一份未加入BrdU的細胞,此后的實(shí)驗處理與摻入組保持一致,作為實(shí)驗對照用于流式分析時(shí)確定BrdU的陽(yáng)性圈門(mén)位置。
注:根據細胞和實(shí)驗目的不同,具體的孵育時(shí)間可為30分鐘至48小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)短時(shí)間摻入 (一般為30分鐘到2小時(shí)),可以分析細胞周期。長(cháng)時(shí)間如24小時(shí)以上持續的BrdU摻入可以用于確定和分析處于DNA合成活躍狀態(tài)的細胞,將其與靜止期細胞區分開(kāi)來(lái),從而進(jìn)行增殖細胞比例的分析。針對具體的細胞類(lèi)型和狀態(tài),BrdU的摻入濃度和培育時(shí)間需進(jìn)行預實(shí)驗測試確定。實(shí)驗中,我們對生長(cháng)旺盛狀態(tài)的HeLa細胞加10 μM BrdU處理一小時(shí),摻入*。
1. 注:消化時(shí)不可過(guò)度吹打細胞,注意離心轉速,操作中減少細胞碎片的產(chǎn)生。如要做表面蛋白染色,可改用0.5 mM EDTA/PBS,37 °C孵育10分鐘,再吹打細胞,以獲得單細胞懸液。做好細胞計數,確保不同處理的樣品用于流式染色的細胞數保持一致。細胞固定與通透
3.1
1 ml 1× PBS清洗細胞,4 °C,300 × g離心5分鐘,棄上清。
3.2
先用旋渦混勻器中速轉動(dòng),將沉在管底的細胞輕輕重懸彈起,再逐滴加入100 μl固定/通透液,充分混勻后,置冰上避光孵育30分鐘。
3.3
清洗,加入1 ml染色緩沖液,4 °C,300 × g離心5分鐘,棄上清。
可選:該步驟固定清洗后的細胞,可于4 °C避光保存,72小時(shí)內繼續后面的染色過(guò)程即可。這對實(shí)驗中需要比較加藥處理不同時(shí)間點(diǎn)的樣品,較為適用。
注:固定及通透步驟對于胞內染色至關(guān)重要,為確保工作溶液的穩定和實(shí)驗的重復性,推薦實(shí)驗前新鮮配制,并于4 °C避光保存。
1. 通透
細胞輕輕重懸彈起,加入100 μl通透液,充分混勻后,室溫避光孵育10分鐘。
2. 清洗
加入1 ml染色緩沖液,4 °C,300 × g離心5分鐘,棄上清。
3. 二次固定
重復第3步固定與通透過(guò)程,100 μl固定/通透液,置冰上避光孵育30分鐘。同第5步方法,清洗一次。
4. 脫氧核糖核酸酶DNase I處理
細胞輕輕重懸彈起,加入500 μl DNase I反應緩沖液,充分混勻后,加入25 μl DNase I,放入37 °C水浴鍋中避光反應45分鐘。同第5步方法,清洗兩次。
圖1. BrdU法檢測HeLa細胞的細胞增殖. (A-C) 為沒(méi)有BrdU摻入的對照組;(D-F) 為10 μM BrdU孵育60分鐘后收集的細胞。(A和D) 通過(guò)前、側向散射光信號FSC和SSC散點(diǎn)圖,排除細胞碎片,圈出主群細胞。(B和E) 通過(guò)DNA染料7-AAD的熒光脈沖信號的寬度W和面積A,進(jìn)一步排除樣本中的粘連體,圈出單細胞群體。(C和F) 使用BrdU (對數顯示) 和7-AAD (線(xiàn)性顯示) 的散點(diǎn)圖顯示細胞周期分布,實(shí)驗組 (F) 呈現典型的馬蹄形分布。通過(guò)對照 (C) 確定BrdU陽(yáng)性信號的位置,可以在 (F) 上清楚的區分出G0/G1期、G2/M期和S期,S期比例體現細胞增殖的狀態(tài),不同細胞周期的細胞分群明顯。
溶液配方
1. 1× PBS磷酸鹽緩沖液
1)
800 ml蒸餾水中溶解NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.44 g,KH2PO4 0.24 g
2)
調節pH值到7.2~7.4
3)
加去離子水定容至1 L
4)
0.22 μm濾膜過(guò)濾后,室溫保存
2. BrdU溶液
BrdU溶于1× PBS配成10 mg/ml儲液,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝成31 μl/管,保存于-80 °C,避免反復凍融
實(shí)驗前,于冰上解凍,每31 μl加入1 ml 1× PBS稀釋成1 mM工作液備用
1)
預先加熱80 ml去離子水,燒杯放于通風(fēng)櫥內的磁力攪拌器上,確認水溫低于60 °C
2)
稱(chēng)取10 g多聚甲醛加入熱水中,緩慢攪拌,滴加約200 μl 10 N NaOH使溶液變?yōu)閴A性以助溶
3)
磁力攪拌器加熱使溶液溫度維持在50 °C左右,持續攪拌約1小時(shí),溶液澄清,顯示PFA充分溶解
4)
停止加熱,加入10 ml 10× PBS,待溶液冷卻至室溫,加入鹽酸調整pH值至7.2~7.4,加去離子水定容到100 ml
5)
分裝成4 ml/管,凍存于-20 °C,避免反復凍融
6)
使用前,在室溫充分融化后備用
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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