摘要：細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。研究細胞增殖，對于理解細胞發(fā)育和分化，探索腫瘤發(fā)生和治療，以及評估細胞健康狀況和藥物安全性評價(jià)等都具有重要意義。在檢測細胞增殖的多種方法中，直接測定DNA合成是一種敏感并高精度的分析方法。5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU)，是一種胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物。當細胞處于細胞周期中的DNA合成期 (S期) 時(shí)，BrdU可以摻入到新合成的DNA中。利用抗BrdU的單克隆抗體熒光染色，就可通過(guò)流式細胞術(shù)檢測BrdU的含量，從而定量細胞群體的增殖情況 (Davies和Allen, 2007)。另外，結合核酸染料測定單個(gè)細胞的DNA含量，還可以定性特定細胞在細胞周期中的具體進(jìn)程。該實(shí)驗方案中，運用脫氧核糖核酸酶DNase I消化解開(kāi)DNA雙鏈，使抗體與DNA鏈上的BrdU得以接近和結合。與傳統的醇固定和強酸變性處理的方法相比，該方案更溫和，可同時(shí)對細胞表面及胞內的其他標記物進(jìn)行多色流式分析。

關(guān)鍵詞: 細胞增殖檢測, 細胞周期, 5-溴-脫氧尿嘧啶核苷 (Bromodeoxyuridine，BrdU), 脫氧核糖核酸酶DNase I, 流式細胞術(shù)

材料與試劑

1.       15 ml離心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)

2.      12 × 75 mm的5 ml聚苯乙烯流式管 (BD Falcon, catalog number: 352008)

3.      200目過(guò)濾尼龍網(wǎng)

4.       0.22 μm濾器 (Pall, catalog number: 4612)

5.       HeLa細胞

6.      脫氧核糖核酸酶DNase I (Promega, catalog number: M6101)

7.      胎牛血清FBS (杭州四季青)

8.      小鼠抗BrdU單克隆抗體，克隆號Bu20a (Cell Signaling Technology, catalog number: 5292)

9.       Alexa FluorTM488標記的山羊抗小鼠IgG二抗 (Invitrogen, catalog number: A11001)

1. 核糖核酸酶(RNase) (Roche, catalog number: 11119915001)
2. 5-溴-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Roche, catalog number: 10280879001)
3. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Sigma-Aldrich, catalog number: D8417)
4. 7-氨基放線(xiàn)菌素 (7-AAD) (BD Pharmingen, catalog number: 559925)
5. 皂甙Saponin (Sigma-Aldrich, catalog number: 47036)
6. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
7. NaCl
8.  KCl
9. Na₂HPO₄
10. KH₂PO₄
11.  多聚甲醛 (PFA) (Sigma-Aldrich, catalog number: 76240)
12. 1× PBS磷酸鹽緩沖液 (見(jiàn)溶液配方)
13.  BrdU溶液 (見(jiàn)溶液配方)
14. 10% PFA儲液 (見(jiàn)溶液配方)
15. 10% Saponin儲液 (見(jiàn)溶液配方)
16.  固定/通透液4% PFA/1% Saponin (見(jiàn)溶液配方)
17. 通透液1% Saponin (見(jiàn)溶液配方)
18.  染色緩沖液3% FBS/0.5% Saponin (見(jiàn)溶液配方)
19. PI染色液 (見(jiàn)溶液配方)
20. 7-AAD染色液 (見(jiàn)溶液配方)
21.  DAPI染色液 (見(jiàn)溶液配方)

儀器設備

1.      -80 °C冰箱 (Thermo, model: 905)

2.      二氧化碳培養箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)

3.      旋渦混勻器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)

4.      水浴鍋 (精宏, model: DK-80)

5.      恒溫磁力攪拌器 (虹浦, model: 85-2型)

6.      電子天平 (METTLER-TOLEDO, model: PB602-S)

7.      pH計 (METTLER-TOLEDO, model: FE-20)

8.      臺式冷凍離心機 (Eppendorf, model: 5810R，配A-4-62水平轉子)

9.      流式細胞分析儀 (BD LSRFortessa，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)

軟件

1.      FlowJo軟件

實(shí)驗步驟

1.      BrdU摻入
處于對數生長(cháng)期的HeLa細胞，培液中加入終濃度10 μM的BrdU，5% CO2培養箱中繼續在37 °C下避光培養60分鐘。同時(shí)，培養一份未加入BrdU的細胞，此后的實(shí)驗處理與摻入組保持一致，作為實(shí)驗對照用于流式分析時(shí)確定BrdU的陽(yáng)性圈門(mén)位置。
注：根據細胞和實(shí)驗目的不同，具體的孵育時(shí)間可為30分鐘至48小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)短時(shí)間摻入 (一般為30分鐘到2小時(shí))，可以分析細胞周期。長(cháng)時(shí)間如24小時(shí)以上持續的BrdU摻入可以用于確定和分析處于DNA合成活躍狀態(tài)的細胞，將其與靜止期細胞區分開(kāi)來(lái)，從而進(jìn)行增殖細胞比例的分析。針對具體的細胞類(lèi)型和狀態(tài)，BrdU的摻入濃度和培育時(shí)間需進(jìn)行預實(shí)驗測試確定。實(shí)驗中，我們對生長(cháng)旺盛狀態(tài)的HeLa細胞加10 μM BrdU處理一小時(shí)，摻入*。

1. 終止摻入，收集細胞
2. 2.1
3. 吸凈含有BrdU的培養液，PBS清洗細胞兩次，用0.05%胰酶消化細胞，得到的單細胞懸液收集至15 ml離心管中，細胞計數確定細胞數量。
4. 2.2
5. 4 °C，300 × g離心5分鐘，棄上清。
6. 2.3
7. 用1× PBS重懸細胞，依據細胞數量調整重懸體積，使細胞濃度控制在約2 × 10⁷細胞/ml。
8. 2.4
9. 分裝細胞，每個(gè)15 ml離心管中裝50 μl細胞懸液作為一個(gè)反應體系?？蛇x：如想對細胞表面標記進(jìn)行染色可在此步進(jìn)行。

1.      注：消化時(shí)不可過(guò)度吹打細胞，注意離心轉速，操作中減少細胞碎片的產(chǎn)生。如要做表面蛋白染色，可改用0.5 mM EDTA/PBS，37 °C孵育10分鐘，再吹打細胞，以獲得單細胞懸液。做好細胞計數，確保不同處理的樣品用于流式染色的細胞數保持一致。細胞固定與通透

3.1

1 ml 1× PBS清洗細胞，4 °C，300 × g離心5分鐘，棄上清。

3.2

先用旋渦混勻器中速轉動(dòng)，將沉在管底的細胞輕輕重懸彈起，再逐滴加入100 μl固定/通透液，充分混勻后，置冰上避光孵育30分鐘。

3.3

清洗，加入1 ml染色緩沖液，4 °C，300 × g離心5分鐘，棄上清。

可選：該步驟固定清洗后的細胞，可于4 °C避光保存，72小時(shí)內繼續后面的染色過(guò)程即可。這對實(shí)驗中需要比較加藥處理不同時(shí)間點(diǎn)的樣品，較為適用。
注：固定及通透步驟對于胞內染色至關(guān)重要，為確保工作溶液的穩定和實(shí)驗的重復性，推薦實(shí)驗前新鮮配制，并于4 °C避光保存。

1.      通透
細胞輕輕重懸彈起，加入100 μl通透液，充分混勻后，室溫避光孵育10分鐘。

2.      清洗
加入1 ml染色緩沖液，4 °C，300 × g離心5分鐘，棄上清。

3.      二次固定
重復第3步固定與通透過(guò)程，100 μl固定/通透液，置冰上避光孵育30分鐘。同第5步方法，清洗一次。

4.      脫氧核糖核酸酶DNase I處理
細胞輕輕重懸彈起，加入500 μl DNase I反應緩沖液，充分混勻后，加入25 μl DNase I，放入37 °C水浴鍋中避光反應45分鐘。同第5步方法，清洗兩次。

1. 一抗標記
   小鼠抗BrdU單克隆抗體1:200稀釋于染色緩沖液中。細胞輕輕重懸彈起，加入50 μl一抗反應液，充分混勻后，置冰上避光孵育45分鐘。同第5步方法，清洗兩次。
2. 熒光二抗標記
   Alexa Fluor^TM488標記的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀釋于染色緩沖液中。細胞輕輕重懸彈起，加入50 μl二抗反應液，充分混勻后，置冰上避光孵育20分鐘。同第5步方法，清洗兩次。
3. 核酸染料染色，檢測單個(gè)細胞的DNA含量
   細胞輕輕重懸彈起，再加入100 μl染色液，充分混勻后，室溫避光孵育30分鐘。加入0.5 ml染色緩沖液，無(wú)需清洗，樣品經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后轉移至流式管，放置冰上，等待上機檢測。
   注：常見(jiàn)的DNA染料如PI、7-AAD和DAPI，均可用來(lái)與BrdU結合分析細胞周期。這三種染料的大激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)分別為PI 538 nm/ 617 nm，7-AAD 545 nm/ 650 nm和DAPI 359 nm/ 461 nm。實(shí)驗設計中，可根據流式細胞儀的配置和蛋白標記物染色所用的熒光素，靈活選擇。
4. 上機，采集流式數據分析樣本
   實(shí)驗中所用的BD LSRFortessa流式細胞分析儀，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器。根據細胞儀配置，BrdU的信號由Alexa Fluor^TM488熒光信號標記，用488 nm激光器激發(fā)，采集530/30波段的信號。PI的信號，用561 nm激光器激發(fā)，采集610/20波段。7-AAD的信號，用561 nm激光器激發(fā)，采集670/30波段。DAPI的信號，用355 nm激光器激發(fā)，采集450/50波段。
   注：為確保分析精度，檢測細胞濃度應調整為0.5~2 × 10⁶/ml，進(jìn)樣速度為低速，每秒事件數不大于400，記錄總數不小于20,000細胞。分析時(shí)通過(guò)DNA染料的熒光脈沖信號的寬度和面積，區分樣本中的粘連細胞群體，程度上的減少粘連細胞的影響。DNA染料，特別是PI具有較強的粘性，樣本上機檢測之后，必須仔細清洗流式細胞儀，以免對后續的檢測造成影響。

1. 結果與分析

1. 流式細胞儀上采集的數據導出后，運用FlowJo軟件分析，具體流程及結果如圖1所示。
2. 

圖1. BrdU法檢測HeLa細胞的細胞增殖. (A-C) 為沒(méi)有BrdU摻入的對照組；(D-F) 為10 μM BrdU孵育60分鐘后收集的細胞。(A和D) 通過(guò)前、側向散射光信號FSC和SSC散點(diǎn)圖，排除細胞碎片，圈出主群細胞。(B和E) 通過(guò)DNA染料7-AAD的熒光脈沖信號的寬度W和面積A，進(jìn)一步排除樣本中的粘連體，圈出單細胞群體。(C和F) 使用BrdU (對數顯示) 和7-AAD (線(xiàn)性顯示) 的散點(diǎn)圖顯示細胞周期分布，實(shí)驗組 (F) 呈現典型的馬蹄形分布。通過(guò)對照 (C) 確定BrdU陽(yáng)性信號的位置，可以在 (F) 上清楚的區分出G0/G1期、G2/M期和S期，S期比例體現細胞增殖的狀態(tài)，不同細胞周期的細胞分群明顯。

溶液配方

1.      1× PBS磷酸鹽緩沖液

1)

800 ml蒸餾水中溶解NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄ 1.44 g，KH₂PO₄ 0.24 g

2)

調節pH值到7.2~7.4

3)

加去離子水定容至1 L

4)

0.22 μm濾膜過(guò)濾后，室溫保存

2.      BrdU溶液 
BrdU溶于1× PBS配成10 mg/ml儲液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝成31 μl/管，保存于-80 °C，避免反復凍融
實(shí)驗前，于冰上解凍，每31 μl加入1 ml 1× PBS稀釋成1 mM工作液備用

1. 10% PFA儲液 

1)

預先加熱80 ml去離子水，燒杯放于通風(fēng)櫥內的磁力攪拌器上，確認水溫低于60 °C

2)

稱(chēng)取10 g多聚甲醛加入熱水中，緩慢攪拌，滴加約200 μl 10 N NaOH使溶液變?yōu)閴A性以助溶

3)

磁力攪拌器加熱使溶液溫度維持在50 °C左右，持續攪拌約1小時(shí)，溶液澄清，顯示PFA充分溶解

4)

停止加熱，加入10 ml 10× PBS，待溶液冷卻至室溫，加入鹽酸調整pH值至7.2~7.4，加去離子水定容到100 ml

5)

分裝成4 ml/管，凍存于-20 °C，避免反復凍融

6)

使用前，在室溫充分融化后備用

1. 10% Saponin儲液
   用去離子水配制，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，4 °C避光保存
2. 固定/通透液4% PFA/1% Saponin
   將10% PFA和10% Saponin的儲液稀釋配制于1× PBS溶液中，實(shí)驗前新鮮配制，4 °C避光保存
3. 通透液1% Saponin
   實(shí)驗前于1× PBS溶液中新鮮配制，4 °C避光保存
4. 染色緩沖液3% FBS/0.5% Saponin
   于1× PBS溶液中配制，0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用
5. PI染色液
   50 μg/ml PI，200 μg/ml RNase于1× PBS溶液中配制
6. 7-AAD染色液
   儲液為1 mg/ml溶于DMSO，4 °C避光保存
   染色時(shí)以1:1,000稀釋于1× PBS溶液
7. DAPI染色液
   儲液為5 mg/ml溶于去離子水，4 °C避光保存
   染色時(shí)以1:1,000稀釋于1× PBS溶液

1. 致謝

1. 感謝中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞分析技術(shù)平臺全體成員的建議和幫助。該研究受?chē)易匀豢茖W(xué)基金 (31401157–丁宇波) 的支持。本方法參考改編自2006年發(fā)表在Cytometry Part A的Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry (Rothaeusler和Baumgarth，2006)。

1. 參考文獻

1. Davies, D. and Allen. P. (2007). Chapter 7: DNA Analysis by Flow Cytometry. In: Flow Cytometry. Principles and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press. ISBN: 978-1-58829-691-7.
2. Rothaeusler, K. and Baumgarth, N. (2006). Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry. Cytometry A 69(4): 249-259.

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