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流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI法)
摘要:磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine,PS) 又稱(chēng)復合神經(jīng)酸,位于正常細胞膜的胞質(zhì)一側,在細胞凋亡早期,PS可從細胞膜胞質(zhì)側翻轉到細胞膜外表面?;诖爽F象,利用Ca2 +依賴(lài)性Annexin V可與PS特異性結合,且親和力高,適用于細胞凋亡早中期的檢測。PI為一種核酸染色劑,與細胞核結合將細胞核染為紅色。PI不可透過(guò)正常的細胞膜,可透過(guò)凋亡中晚期以及壞死細胞的細胞膜,適用于在排除細胞壞死的前提下細胞凋亡中晚期檢測。將Annexin V與PI同時(shí)使用,通過(guò)分群表征出正常、壞死、凋亡和機械性損傷的細胞。在該實(shí)驗中,我們對HeLa細胞的對照組和H2O2誘導組進(jìn)行Annexin V/PI雙標記,經(jīng)流式細胞儀檢測出不同特性的細胞群。
關(guān)鍵詞: 細胞凋亡, Annexin V/PI, 流式檢測, HeLa細胞
材料與試劑
1. 5 ml流式管 (Falcon,catalog number: 352008)
2. 15 ml離心管 (Falcon,catalog number: 352097)
3. HeLa細胞
4. Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen,catalog number: A13201)
5. PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich,catalog number: P4170)
6. NaCl
7. Na2HPO4
8. KCl
9. KH2PO4
10. H2O2
儀器設備
1. 水平離心機 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)
2. 光學(xué)顯微鏡 (Olympus, model: IX73)
3. 流式細胞儀 (FACSFortessa)
實(shí)驗步驟
1. 染色前處理
1.1
將收集到的細胞,用預冷1× PBS (4 °C) 重懸一次,300 × g , 離心5分鐘,棄上清,收集細胞。
1.2
加入300 μl的1× Binding Buffer重懸細胞,調整細胞濃度至1 × 106/ml。
2. Annexin V/PI染色
圖2. Annexin V/PI雙標記HeLa細胞凋亡檢測
9.
如圖1所示通過(guò)前向 (FSC) 和側向 (SSC),分別圈出的對照組和H2O2誘導組的HeLa細胞范圍有所差別。誘導凋亡組的細胞已呈現出分群的趨勢。圖2為Annexin V/PI雙標記的結果,如圖2A所示對照組的HeLa細胞處于正常狀態(tài),但也有少許凋亡晚期的細胞,原因是培養的HeLa細胞濃度過(guò)高,導致培養基里的營(yíng)養消耗過(guò)快,少許細胞因饑餓發(fā)生凋亡。圖2B中顯示,經(jīng)H2O2誘導HeLa細胞出現了顯著(zhù)的早期凋亡現象,比例由1.06%增至7.43%;凋亡晚期的細胞比例呈明顯增長(cháng)趨勢。綜上可知,雙標記方法可以準確地反映凋亡過(guò)程:Annexin V標記的單陽(yáng)性細胞為凋亡早期細胞;Annexin V 與PI雙標記的雙陽(yáng)性細胞為凋亡晚期細胞 (Koç,等,2018);PI標記的單陽(yáng)性細胞為壞死細胞;兩者均未標記上的雙陰性細胞為活細胞。由此將凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、壞死細胞與正常細胞區別開(kāi)。因此,可作為檢測細胞凋亡的好方法 (Schutte等,1998) 。
注意事項
1. 使用前低速離心,以免液體積存管蓋和管壁。
2. 如果用含EDTA的胰酶消化時(shí),注意必須*清除EDTA:在標記前用1× PBS或 1× Binding buffer洗滌,清除EDTA,以免殘余的EDTA與Ca2+螯合,影響Annexin V的結合。
3. Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物質(zhì),在操作時(shí)請注意避光。在處理和標記時(shí),盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段,用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后,在暗室內用顯微鏡觀(guān)察。
4. 整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞,盡量在4 °C下操作,以免影響細胞狀態(tài)。
5. 在細胞洗滌后,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留,有可能會(huì )影響實(shí)驗結果。
6. 為防止熒光衰變,宜在1小時(shí)內進(jìn)行流式檢測。
7. PI染色時(shí)間過(guò)長(cháng)有可能造成檢測的凋亡率偏高,建議首先進(jìn)行Annexin V-Alexa Fluor™488染色,可在上機前5分鐘再加入PI染色。
溶液配方
1. PBS
NaCl 8 g
Na2HPO4 2.9 g
KCl 0.2 g
KH2PO4 0.2 g
溶于1L ddH2O中,調pH值為7.2~7.4
過(guò)濾滅菌
4 °C保存
2. 800 μM H2O2
取30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中,配成20 mM的母液
再取80 μl母液溶于2 ml DEME培養基
3. PI染色工作液
1 mg/mL PI原液+無(wú)菌PBS按1:10稀釋成100 μg/ml工作液
4 °C保存待用
4. 1× Binding buffer
10 mM HEPES
140 mM NaCl
2.4 mM CaCl2
pH 7.4
參考文獻
1. Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.
2. Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.
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