流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI法)

Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI 

摘要：磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine，PS) 又稱(chēng)復合神經(jīng)酸，位于正常細胞膜的胞質(zhì)一側，在細胞凋亡早期，PS可從細胞膜胞質(zhì)側翻轉到細胞膜外表面?；诖爽F象，利用Ca^{2 +}依賴(lài)性Annexin V可與PS特異性結合，且親和力高，適用于細胞凋亡早中期的檢測。PI為一種核酸染色劑，與細胞核結合將細胞核染為紅色。PI不可透過(guò)正常的細胞膜，可透過(guò)凋亡中晚期以及壞死細胞的細胞膜，適用于在排除細胞壞死的前提下細胞凋亡中晚期檢測。將Annexin V與PI同時(shí)使用，通過(guò)分群表征出正常、壞死、凋亡和機械性損傷的細胞。在該實(shí)驗中，我們對HeLa細胞的對照組和H₂O₂誘導組進(jìn)行Annexin V/PI雙標記，經(jīng)流式細胞儀檢測出不同特性的細胞群。

關(guān)鍵詞: 細胞凋亡, Annexin V/PI, 流式檢測, HeLa細胞

材料與試劑

1.      5 ml流式管 (Falcon，catalog number: 352008)

2.      15 ml離心管 (Falcon，catalog number: 352097)

3.      HeLa細胞

4.      Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen，catalog number: A13201)

5.      PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich，catalog number: P4170)

6.      NaCl 

7.      Na₂HPO₄ 

8.      KCl 

9.      KH₂PO₄

10.  H₂O₂

1. DEME培養基
2. HEPES
3. CaCl₂
4. PI染色工作液 (見(jiàn)溶液配方)
5. 1× Binding buffer (見(jiàn)溶液配方)
6. PBS (見(jiàn)溶液配方)
7. 800 μM H₂O₂ (見(jiàn)溶液配方)

儀器設備

1.      水平離心機 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2.      光學(xué)顯微鏡 (Olympus, model: IX73)

3.      流式細胞儀 (FACSFortessa)

實(shí)驗步驟

1.      染色前處理

1.1

將收集到的細胞，用預冷1× PBS (4 °C) 重懸一次，300 × g , 離心5分鐘，棄上清，收集細胞。

1.2

加入300 μl的1× Binding Buffer重懸細胞，調整細胞濃度至1 × 10⁶/ml。

2.      Annexin V/PI染色

1. 取流式管，按順序編好空白管，單陽(yáng)管和樣本管號。流式管中分別加入經(jīng)200目細胞過(guò)濾膜過(guò)濾好的100 μl細胞懸液，單陽(yáng)管中分別加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶輕輕混勻。
2. 2.2
3. 樣本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488輕輕混勻；再加入10 μl PI碘化丙啶輕輕混勻。
4. 2.3
5. 室溫避光孵育10~20分鐘，加入400 μl 1× Binding Buffer，隨后置于冰浴中，上機檢測，所選通道如下：
   Alexa Fluor™488：488 nm激發(fā)，采集波段530/30；
   PI：561 nm激發(fā)，采集波段610/20。
6. 
7.  
8.                 圖1. 前向 (FSC) 和側向 (SSC) 圈出HeLa細胞

               圖2. Annexin V/PI雙標記HeLa細胞凋亡檢測

9.     
如圖1所示通過(guò)前向 (FSC) 和側向 (SSC)，分別圈出的對照組和H₂O₂誘導組的HeLa細胞范圍有所差別。誘導凋亡組的細胞已呈現出分群的趨勢。圖2為Annexin V/PI雙標記的結果，如圖2A所示對照組的HeLa細胞處于正常狀態(tài)，但也有少許凋亡晚期的細胞，原因是培養的HeLa細胞濃度過(guò)高，導致培養基里的營(yíng)養消耗過(guò)快，少許細胞因饑餓發(fā)生凋亡。圖2B中顯示，經(jīng)H₂O₂誘導HeLa細胞出現了顯著(zhù)的早期凋亡現象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的細胞比例呈明顯增長(cháng)趨勢。綜上可知，雙標記方法可以準確地反映凋亡過(guò)程：Annexin V標記的單陽(yáng)性細胞為凋亡早期細胞；Annexin V 與PI雙標記的雙陽(yáng)性細胞為凋亡晚期細胞 (Koç,等，2018)；PI標記的單陽(yáng)性細胞為壞死細胞；兩者均未標記上的雙陰性細胞為活細胞。由此將凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、壞死細胞與正常細胞區別開(kāi)。因此，可作為檢測細胞凋亡的好方法 (Schutte等，1998) 。

注意事項

1.      使用前低速離心，以免液體積存管蓋和管壁。

2.      如果用含EDTA的胰酶消化時(shí)，注意必須*清除EDTA：在標記前用1× PBS或 1× Binding buffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2+螯合，影響Annexin V的結合。

3.      Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請注意避光。在處理和標記時(shí)，盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后，在暗室內用顯微鏡觀(guān)察。

4.      整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞，盡量在4 °C下操作，以免影響細胞狀態(tài)。

5.      在細胞洗滌后，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留，有可能會(huì )影響實(shí)驗結果。

6.      為防止熒光衰變，宜在1小時(shí)內進(jìn)行流式檢測。

7.      PI染色時(shí)間過(guò)長(cháng)有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-Alexa Fluor™488染色，可在上機前5分鐘再加入PI染色。

溶液配方

1.      PBS
NaCl 8 g
Na₂HPO₄ 2.9 g
KCl 0.2 g
KH₂PO₄ 0.2 g
溶于1L ddH₂O中，調pH值為7.2~7.4
過(guò)濾滅菌
4 °C保存

2.      800 μM H₂O₂ 
取30% H₂O₂ 2 μl溶于880 μl 1× PBS中，配成20 mM的母液
再取80 μl母液溶于2 ml DEME培養基

3.      PI染色工作液
1 mg/mL PI原液+無(wú)菌PBS按1:10稀釋成100 μg/ml工作液
4 °C保存待用

4.      1× Binding buffer
10 mM HEPES
140 mM NaCl
2.4 mM CaCl₂
pH 7.4

參考文獻

1.      Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.

2.      Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.

1. Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
2. 引用格式：葛靈, 王雪冬, 丁宇波, 邊瑋. (2019). 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI法). Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
   How to cite: Ge, L., Wang, X. D., Ding Y. B. and Bian, W. (2019). Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI.Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.