摘要：人外周血是容易獲取的人體樣本，在醫學(xué)類(lèi)科研工作中至關(guān)重要。如何大化、高效地觀(guān)察和利用有限的人外周血標本，通過(guò)一次實(shí)驗檢測得到更多的結果指標，對現有的實(shí)驗研究意義重大。因此本文主要描述如何進(jìn)行25色流式檢測及介紹相關(guān)分析方法，通過(guò)對單個(gè)細胞同時(shí)檢測25個(gè)參數，可以實(shí)現對外周血各種免疫細胞亞群的全景式描述，以及對某種細胞亞群的深度表型分析。

關(guān)鍵詞: 人外周血, 亞群分類(lèi), 25色流式分析

材料與試劑

材料：

1. 15 ml離心管 (Corning, catalog number: 430791)
2. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
3. 1.5 ml離心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
4. 96孔圓底板 (Corning, catalog number: 351177)
5. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)
6. 70 μm濾膜 (Corning, catalog number: 352350)
7. 肝素抗凝管
8.  
9. 試劑：
10. Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set (Ms Ig Kpa Comp Bead Set 6Ml, BD Biosciences, catalog number: 552843) 
11. Lonsera烏拉圭 (南美) 特級胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
12. Lymphoprep (Stemcell, catalog number: 07851)
13. 20x PBS緩沖液 (生工，catalog number: B548117)
14. 0.5 mol/L EDTA (生工，catalog number: B300599)
15. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
16. 1x PBS (見(jiàn)溶液配方)
17. FACS buffer (見(jiàn)溶液配方)
18. 抗體混合物 (見(jiàn)溶液配方)
19. 抗體：
20. Mouse antihuman CD32-BUV395 (BD Biosciences, custom)
21. Mouse antihuman CD16-BUV496 (BD Biosciences, custom)
22. Mouse antihuman CD19-BUV563 (BD Biosciences, custom)
23. Mouse antihuman IgD-BUV615 (BD Biosciences, custom)
24. Mouse antihuman CD4-BUV661 (BD Biosciences, custom)
25. Mouse antihuman CD64-BUV737 (BD Biosciences, custom)
26. Mouse antihuman CD14-BUV805 (BD Biosciences, custom)
27. Mouse antihuman CD57-BV421 (BD Biosciences, custom)
28. Mouse antihuman CD3-BV480 (BD Biosciences, custom)
29. Mouse antihuman CD27-BV711 (BD Biosciences, custom)
30. Mouse antihuman CD20-BV750 (BD Biosciences, custom)
31. Mouse antihuman CD197-BV786 (BD Biosciences, custom)
32. Mouse antihuman CD45RA-BB515 (BD Biosciences, custom)
33. Mouse antihuman TCRgd-BB630 (BD Biosciences, custom)
34. Mouse antihuman CD195-BB660 (BD Biosciences, custom)
35. Mouse antihuman CD8-Percp-cy5.5 (BD Biosciences, custom)
36. Mouse antihuman CD38-BB790 (BD Biosciences, custom)
37. Mouse antihuman CD11c-PE (BD Biosciences, custom)
38. Mouse antihuman CD13-PE-CF594 (BD Biosciences, custom)
39. Mouse antihuman CD123-PE-Cy5 (BD Biosciences, custom)
40. Mouse antihuman CD25-PE-Cy7 (BD Biosciences, custom)
41. Mouse antihuman CD127-AF647 (BD Biosciences, custom)
42. Mouse antihuman CD56-APC-R700 (BD Biosciences, custom)
43. Mouse antihuman HLA-DR-APC-H7 (BD Biosciences, custom)

儀器設備

1. 實(shí)驗室2級生物安全柜 (Thermo Scientific™ 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
2. 高速離心機 (Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 40離心機)
3. 倒置相差顯微鏡 (Olympus, model: CKX41)
4. 血細胞計數板 (Sigma-Ardrich, model: BR717805-1EA)
5. X30流式細胞分析儀 (BD FACSymphony™系統)
6. 電動(dòng)移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)

實(shí)驗步驟

一． 人外周血免疫細胞的制備 (Gupta等，2013)

1. 準備潔凈的15 ml離心管，倒入3 ml lymphoprep。抽取健康人外周血置于肝素抗凝管中備用，在無(wú)菌的15 ml離心管中加入3 ml人外周血, 再加入3 ml 1x PBS后 (文中未特殊說(shuō)明均為1x PBS) 進(jìn)行混勻稀釋。左手傾斜離心管，右手用移液器吸取稀釋后的外周血緩慢加到lymphoprep表面，形成密度梯度。在加入外周血的過(guò)程中，可適當緩慢擺正離心管，注意加液體時(shí)要輕柔，移液器的速度調整到低，以免將lymphoprep和外周血混勻 。
2. 400 x g，20 min，升速 (ACC) 1，降速 (DEC) 0，室溫進(jìn)行密度梯度離心。
3. 離心結束后離心管內液體分為5層，從上到下分別為：血漿，外周血單個(gè)核免疫細胞 (包括外周血單核細胞和淋巴細胞等)，lymphoprep，粒細胞，紅細胞 (圖2)。準備干凈的15 ml離心管，加入10 ml PBS，用吸管吸取第二層的外周血免疫細胞并轉入含有PBS的離心管中，上下顛倒后放入離心機800 x g，10 min室溫離心
4. 離心結束后去上清，輕彈管底，再加入10 ml PBS，上下顛倒后放入離心機400 x g，5 min室溫離心。
5. 重復步驟4清洗外周血免疫細胞以*去除殘留的lymphoprep。
6. 后得到的細胞沉淀就是外周血免疫細胞，可用PBS重懸細胞后進(jìn)行細胞計數。理論上，1 ml外周血可得到1 x 106左右外周血免疫細胞。二． 25色流式染色實(shí)驗 (參考文獻1)

25色流式染色和正常流式染色步驟一致，本實(shí)驗研究的25色全景分析所用的抗體均為表面抗體，因此只需要進(jìn)行常規流式表面染色。

1. 配制抗體混合物。一個(gè)反應體系為100 μl，按照抗體說(shuō)明書(shū)建議的稀釋比例 (2.5 μl/test) 用FACS buffer (見(jiàn)溶液配方) 對不同的抗體進(jìn)行稀釋。
   注：由于體積為100 μl，且人相關(guān)抗體的使用量較多，所以溶劑FACS buffer的體積需要減去各個(gè)抗體的使用體積。且所有的抗體需要避光操作，避免熒光猝滅；抗體開(kāi)蓋之前需要先離心避免管壁上的抗體飛濺引起浪費；抗體不易長(cháng)時(shí)間在室溫放置，建議置于冰上使用。
2. 取1 x 106個(gè)外周血免疫細胞，用抗體混合物重懸細胞，置于96孔板中，充分混勻后4 °C避光孵育30 min。
3. 染色結束后，直接加入150 μl FACS buffer清洗細胞，400 x g，5 min室溫離心。
4. 離心結束后去上清，用300 μl FACS buffer分兩次重懸細胞沉淀，再將細胞通過(guò)70 μm濾膜過(guò)濾到流式管中，即可上機觀(guān)察。
5. 在表面染色的過(guò)程中，我們需要制作25色染色方案的單染管用于流式自動(dòng)調節補償。取26個(gè)流式管，分別標上各個(gè)通道的熒光名稱(chēng)，第26個(gè)為空白管，每個(gè)流式管中加入兩滴Ms Ig Kpa Comp Bead (約有50 μl的體積)，混勻后，對應管壁上標注的熒光通道加入之前染色使用的表面抗體各0.25 μl，1:200稀釋。充分振蕩混勻后4 °C避光孵育15 min，各加入400 μl FACS buffer，混勻后即可用于流式分析。
6. 注：Ms Ig Kpa Comp Bead使用前需要充分搖勻。
7. 
   三． 25色全景分析 (van der Maaten和Hinton，2008；Wallach和Liliean，2009；Monaco等，2016)

得到流式結果后，需要使用正版flowjo V10軟件對結果進(jìn)行全面分析在flowjo V10中導入數據后，我們需要對25色補償進(jìn)行手動(dòng)調整。主要是因為小球調整的補償和細胞真實(shí)的補償存在一定的差異，所以還需要手動(dòng)確認去除原始數據中由于液流不穩定等機器原因導致的噪音信號。主要使用plugin插件中的flow AI得以實(shí)現 注：使用flow AI選擇參數時(shí)，必須選中time參數，不然將無(wú)法計算相關(guān)參數。運行結束后，我們將看到原始數據拆分成了bad events和good events兩項。之后我們可以對good events進(jìn)行常規的圈門(mén)統計分析正版flowjo包含了很多實(shí)用性的插件：t-SNE，SPADE，FlowSOM，Phenograph，UMAP等等。其中本實(shí)驗主要運用了t-SNE這個(gè)算法對25色結果進(jìn)行全景分析。t-SNE主要對多參數的數據進(jìn)行降維分析，通過(guò)定義納入分析的參數通道，算法可將細胞分成不同距離遠近的點(diǎn)，距離越遠代表細胞相似度越低。我們在圈出的淋巴細胞的基礎上，先downsample出7萬(wàn)個(gè)淋巴細胞，針對這7萬(wàn)個(gè)細胞，我們選中除FSC、SSC相關(guān)參數以外的所有補償后的熒光參數 (一共25個(gè)通道參數)，進(jìn)行t-SNE分析

1. 分析結束后，結合傳統的淋巴細胞亞群定義 (即結果圖7中的圈門(mén)方法)，我們在layout界面將這幾群細胞以t-SNE1和t-SNE2為橫縱坐標的點(diǎn)圖merge在一起并導出，結束分析。

結果與分析

本實(shí)驗先根據細胞大小和包含的顆粒度，即FSC和SSC，將人外周血免疫細胞主要分成淋巴細胞群和單核細胞群等。然后，我們觀(guān)察了CD3、CD19的表達情況，其中CD3+為T細胞群，占白細胞64.6%，CD19+為B細胞群，占白細胞8.45%。細分T細胞，通過(guò)CD4和CD8，可以將T細胞分為輔助T細胞和殺傷性T細胞，兩者分別占T細胞的64%和30%。對于輔助T細胞，我們還檢測了其中一個(gè)亞群Treg的比例，其約占輔助T細胞的7.85%。CD3+CD56+的細胞群為NKT細胞，大約占T細胞的5.72%。細分B細胞，IgD+的naïve B細胞約占總B細胞的52.1%，CD27+的記憶B細胞約占總B細胞的27%。根據文獻報道的不同免疫細胞亞群的定義，在本次實(shí)驗中主要劃分了T細胞 (CD3+)、B細胞 (CD19+)、NKT細胞 (CD3+CD56+)、NK細胞(CD3-CD19-CD16+CD56+)、DC(CD3-CD19-CD56-HLA DR+)、單核細胞(CD3-CD19-CD14+)等不同免疫細胞亞群。D3-CD19-的雙陰性細胞群既包含淋巴細胞群又包含單核細胞群。因此根據CD14的表達情況和細胞內顆粒度 (SSC)，可將細胞群劃分為CD14+單核細胞群和CD14-淋巴細胞群。細分CD14-CD3-CD19-淋巴細胞群，其中CD56+為NK細胞，約有84.9%的細胞高表達CD94，用于識別MHC I。而CD56-為DC細胞群，其中約有52.3%表達HLA-DR。存在的問(wèn)題是，本次實(shí)驗關(guān)于單核細胞群的分類(lèi)并不明顯，猜測是本次樣品粒細胞群不明顯的問(wèn)題。通過(guò)25色大panel，我們可以大程度一次性觀(guān)察所有人外周血免疫細胞亞群并得到相應的細胞比例。取7萬(wàn)個(gè)免疫細胞進(jìn)行t-SNE分析，分析參數為補償后的25個(gè)maker。A. 流式圈門(mén)后的不同細胞群顯示t-SNE界面并合并在一起得到細胞群降維后的分布形態(tài)。B. 在t-SNE分布圖上根據每個(gè)細胞CD45RA的表達情況 (即平均熒光強度) 做的熱圖，紅色代表CD45RA表達高，藍色代表表達低。t-SNE全稱(chēng)t-distributed stochastic neighbor embedding，可將多維參數經(jīng)迭代計算后在二維坐標軸上進(jìn)行展示。通過(guò)計算，t-SNE分布圖由多個(gè)散點(diǎn)組成，每個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)細胞，兩個(gè)散點(diǎn)之間的距離代表著(zhù)兩個(gè)細胞的相似程度。距離越近，則相似程度越高。另外，在正版flowjo V10版本中，還可以觀(guān)察t-SNE heatmap，即在t-SNE坐標軸中展示某一個(gè)參數的表達水平。在圖8A中，明顯的比例高的紅色細胞群為輔助T細胞，粉色的Treg細胞群位于其中，這與Treg屬于輔助T細胞這一常識相一致，說(shuō)明本次t-SNE分析可信。由于NKT細胞表達CD4或CD8，因此一部分NKT亞群靠近輔助T細胞，一部分NKT靠近殺傷性T細胞，因而紫色的NKT細胞表現出很高的異質(zhì)性。因為t-SNE是綜合25個(gè)參數進(jìn)行的分析，所以我們可以發(fā)現不同淋巴細胞內部的異質(zhì)性。圖8B中T細胞的異質(zhì)性主要體現在CD45RA的表達上，由于不同的T細胞關(guān)于CD45RA的表達不一致，從而出現明顯的亞群分類(lèi)。另外，加入其它有意義的maker，有助于發(fā)現新的細胞亞群。

1. 需要資料圖片視頻，請聯(lián)系超博生物。