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細胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細胞，即感受態(tài)細胞（Compenentcells）。1實(shí)驗方法原理：帶有外源DNA的重組質(zhì)粒，在體外構建后，導入宿主細胞，隨著(zhù)細胞的大量復制、繁殖，才能夠有機會(huì )獲得純的重組質(zhì)粒DNA，該過(guò)程稱(chēng)之為轉化過(guò)程。受體細胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源DNA的載體分子通過(guò)。2實(shí)驗材料、試劑、儀器耗材：...
1、畢氏酵母氯化鋰轉化法（1）試劑1MLiCl（用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌；必要時(shí)用消毒去離子水稀釋?zhuān)?0%PEG3350（SigmaP3640用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝）2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存注：醋酸鋰對畢氏酵母無(wú)效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；（2）感受態(tài)畢氏酵母的制備接種Pachiapastoris到50mlY...
IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結合位點(diǎn)共同構成lac操縱子的調控區，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調控區調節，實(shí)現基因產(chǎn)物的協(xié)調表達。在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，la...
材料試劑：胰化蛋白胨，酵母提取物，瓊脂，NaCl，NaOH（調pH），氨芐青霉素，卡那霉素，質(zhì)粒提取試劑盒儀器：高壓滅菌鍋，42℃恒溫水浴鍋，，恒溫搖床（37℃,225rpm），無(wú)菌培養板，消毒1.5ml離心管，消毒槍頭，無(wú)菌操作臺實(shí)驗步驟：1.LB培養基的配制：在950ml去離子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解.用5mol/LNaOH調pH至7.0.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.固態(tài)培養基LB固體培養基...
一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結果使得蛋白活性低或無(wú)活性。不僅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻譯后加工，例如二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等等，而這些加工原核細胞則無(wú)能為力。一些真核蛋白在原核宿主細胞中的表達不但行之有效而且成本低廉，然而許多在細菌中合成的真核蛋白或因折疊方式不正確，或因折疊效率低下，結果使得蛋白活性低或無(wú)活性。不僅如...
轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專(zhuān)門(mén)技術(shù)。隨著(zhù)基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實(shí)驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學(xué)介導和生物介導三類(lèi)途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過(guò)物理方法將基因導入細胞的范例；化學(xué)介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導的技術(shù)；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉染，和現在比較多見(jiàn)的各種病毒介導的轉染技術(shù)。理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導的轉染技術(shù)，...
農桿菌感受態(tài)細胞的制備［實(shí)驗原理］在利用根癌農桿菌介導的基因轉化中，首先要獲得含有目的基因的農桿菌工程菌株。在基因工程操作中，感受態(tài)細胞的制備和質(zhì)粒的轉化是一項基本技術(shù)。感受態(tài)是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導產(chǎn)生。將正在生長(cháng)的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會(huì )使細菌細胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細胞呈現出感受態(tài)。制備好的農桿菌感受態(tài)細胞迅速冷凍于-70℃可保存相當一段時(shí)間而不會(huì )對其轉化效率有太大的影...
基于片段的新藥研發(fā)新技術(shù)FBDD作者：毛博新藥的研發(fā)是—件耗資巨大而效率很低的工作，為了增加新藥研發(fā)的效率，科學(xué)家們一直致力于尋找新的藥物設計和藥物篩選的方法。1990年代，Jencks提出了“基于片段的藥物研發(fā)”(fragment-baseddrugdiscovery，FBDD)這一概念，即通過(guò)對于靶標結合的片段分子篩選和優(yōu)化可以得到新穎的藥物實(shí)體。Cell一篇綜述詳細解釋和闡述了這一新的技術(shù)，并簡(jiǎn)單概述了B-RAF、HSP90和BACE的開(kāi)發(fā)過(guò)程。什么是FBDD技術(shù)？FB...
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