小鼠小膠質(zhì)細胞

小鼠小膠質(zhì)細胞   主要試劑：

(1) PBS：用購自中山公司的PBS粉劑，每袋加ddH2O定容至1000ml，調pH7.2，高壓滅菌消毒。

(2) 0.25%胰蛋白酶消化液：使用時(shí)濃度為0.25%，含0.02%EDTA，制備時(shí)即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液，并在無(wú)菌操作臺上用0.22um一次性過(guò)濾器過(guò)濾，50ml分裝，4℃保存。

(3) 接種液配制：用DMEM-F12 基礎培養90%，再加入10%胎牛血清，后按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。

（4) 抗生素：青霉素(80萬(wàn)U)和鏈霉素(100萬(wàn)U)在無(wú)菌操作臺內以高壓滅菌過(guò)的雙蒸水溶解分別加入4ml滅菌水/青霉素，5ml滅菌水/鏈霉素)，配制成20萬(wàn)u/ml分裝，置于-20℃冰箱保存，臨用時(shí)4℃解凍，注意盡量避免反復凍融，并使培養基終濃度為100 u/ml。

（5）0.01% L-多聚賴(lài)氨酸溶液的配制：稱(chēng)量 10mg L-多聚賴(lài)氨酸，溶于 100ml 滅菌去離子水，0.22μm 正壓濾器過(guò)濾分裝，-20℃保存。

（6）0.4%臺盼藍溶液的配制

臺盼藍 4 g

PBS 少許（研磨）

PBS 定容至 100ml，濾紙過(guò)濾，室溫保存。

（7）4%多聚甲醛的配制：

多聚甲醛 4 g

PBS 溶液 100ml

加熱至 60℃，邊滴加 1mol/L NaOH 邊攪拌，至液體澄清。

（8）四噻唑蘭溶液配制：

MTT 50mg

PBS 10ml

磁力攪拌 30min，滅菌 0.22µm 微孔濾膜過(guò)濾分裝，4℃保存，兩周有效。

實(shí)驗步驟：

1.培養板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

（2）經(jīng) 5%鹽酸浸泡30min，自來(lái)水沖洗20min，三蒸水沖洗，浸泡過(guò)夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤干，放入 24 孔細胞培養板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴(lài)氨酸溶液包被培養皿和小玻片，37℃恒溫孵育 4h 或常溫過(guò)夜。

去除 L-多聚賴(lài)氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養孔及小玻片，晾干備用。

2.小鼠小膠質(zhì)細胞的混合培養

(1) 75%（體積分數）酒精消毒新生 24h 內的清潔級小鼠，在無(wú)菌條件下斷頭，剪開(kāi)頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH7.2,無(wú)鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。小鼠小膠質(zhì)細胞