我們知道，在細胞培養 檢測實(shí)驗在實(shí)驗儀器、培養基等等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發(fā)明了細胞保存這個(gè)實(shí)驗步驟，將暫時(shí)多出來(lái)的細胞冰凍保存，以極大程度保存細胞活力。

一、細胞冷凍保存

1. 材料：

生長(cháng)良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO (Sigma D-2650)、無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene　5000-0020)、0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤(pán)與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)

2. 冷凍保存方法：

(1)傳統方法: 冷存管置于4 ℃10分鐘--->-20 ℃30分鐘--->-80 ℃ 16～18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長(cháng)期儲存。

-20 ℃不可超過(guò)1小時(shí)，以防止胞內冰晶過(guò)大，造成細胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3 ℃/分鐘之速度由室溫降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase長(cháng)期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

3. 步驟：

(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長(cháng)期。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。

(3)離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0. 1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。

(4)取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細胞凍存懸液(DMSO后濃度為5～10%)，使細胞濃度為1～5×106cells/ ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1～2 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱(chēng)、代數、日期。然后進(jìn)行凍存。

4. 注意事項：

(1)欲冷凍保存之細胞應在生長(cháng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

(2)細胞在液氮中可長(cháng)期凍存無(wú)*，而不會(huì )影響細胞活力;在-70度可保存數月。

(3)注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應為試劑級等級，無(wú)菌且無(wú)色(以0. 22micron　FGLP　TeIflon過(guò)濾或是直接購買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小體積分裝，4 ℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內使用，因長(cháng)期儲存后對細胞會(huì )有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。

(4)冷凍保存之細胞濃度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ ml

②hybridoma:1～3×106cells/ ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì )因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后凋亡。

③adherent tumor lines:5～7×106，依細胞種類(lèi)而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ ml

④other suspensions:5～10×106cells/ ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ ml。

(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。

(6)凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4度時(shí))，復蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養細胞，以90%血清凍存更為有效。

二、冷凍細胞活化

1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。

2. 細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長(cháng)或特性表現才會(huì )恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3. 材料

37 ℃恒溫水槽、新鮮培養基、無(wú)菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器

4. 步驟：

(1)操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。

(3)將新鮮培養基置于37 ℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺內。

(4)取出冷凍管，立即放入37 ℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺內。

(5)取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0. 1 ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

(6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類(lèi)而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml培養基之離心管內，離心1000 rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。

(7)若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。

三、細胞計數與存活測試

1. 原理：

(1)計算細胞數目可用血球計數盤(pán)或是Coultercounter粒子計數器自動(dòng)計數。

(2)血球計數盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細刻9個(gè)1 mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細刻16個(gè)小格，深度均為0. 1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1 mm2×0. 1 mm=1. 0x10-4 ml。使用時(shí)，計數每個(gè)大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每 ml中之細胞數目。

(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì )滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì )呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。計數應在臺盼蘭染色后數分鐘內完成，隨時(shí)間延長(cháng)，部分活細胞也開(kāi)始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數更為準確。

2. 材料：

0. 4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0. 1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0. 05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100 mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。

3. 步驟：

(1)取50 μl細胞懸浮液與50 μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1. 5 ml小離心管中。

(2)取少許混合液(約15 μl)自血球計數盤(pán)chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀(guān)察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。

(3)計數四個(gè)大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，后乘以104，即為每 ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線(xiàn)上，只計上線(xiàn)與右線(xiàn)之細胞(或計下線(xiàn)與左線(xiàn)之細胞)。

注：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ ml;每一大格的體積=0. 1 cm×0. 1 cm×0. 01 cm=10-4 ml

計數板計數時(shí)，適濃度為5～10×105細胞/ ml，此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續稀釋后計數。

4. 范例：

T75 monolayer culture制成10 ml細胞懸浮液，取0. 1 ml溶液與0. 1 ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤(pán)，計數四大方格內之細胞數目。

活細胞數/方格：55，62，49，59;死細胞數/方格：5，3，4，6;細胞總數=243

平均細胞數/方格=60. 75;稀釋倍數=2;

細胞數/ ml：60. 75×104×2(稀釋倍數)=1. 22×106;

細胞數/flask(10 ml)：1. 22×106×10 ml=12. 2×106

其實(shí)理論上講處于細胞增殖期之前的細胞都可用于凍存，不過(guò)如果想要更好的效果，還得取對數生長(cháng)期的細胞，并注意做好凍存前的換液工作。溫馨提示，從凍存管將細胞放入或取出時(shí)，都好做好保護工作，以免受凍。