1 AGPG被鑒定為作為代謝相關(guān)的LncRNA

為了發(fā)現對ESCC發(fā)育有顯著(zhù)影響的致癌LncRNA，我們首先從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據庫中鑒定出在ESCC組織中表達高于成對相鄰正常組織的LncRNA。然后，我們根據log2差異倍數對這些LncRNA進(jìn)行分類(lèi)。接下來(lái)，我們建立了一個(gè)siRNA庫，對于siRNA進(jìn)行篩選，這些siRNAs還包含了TARGETplus上的專(zhuān)有雙鏈化學(xué)修飾，以確保zui佳的鏈負載和干擾類(lèi)似microRNA的種子活性，從而減少非目標效應。為了確定可能改變葡萄糖代謝的LncRNA，我們將siRNA文庫轉染到兩個(gè)人ESCC細胞中，檢測細胞活力和乳酸生成。我們發(fā)現14個(gè)LncRNA可能是細胞增殖所必需的，10個(gè)參與乳酸的產(chǎn)生，8個(gè)可能參與細胞活力和葡萄糖代謝（圖1a）。在這8個(gè)低分子RNA中，AGPG基因敲除顯著(zhù)降低了細胞活力和乳酸生成（圖1b）。生物信息學(xué)分析顯示，AGPG位于染色體1q32.1上，有3個(gè)外顯子（1-56、10447-10526和11304-13488）。我們關(guān)注的是AC098934.2-201亞型，為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，我們將該亞型稱(chēng)為AGPG。然后，我們在人食管鱗癌細胞和正常食管上皮細胞（Het-1A和NE-1）中驗證了AGPG的表達shui平，我們發(fā)現腫瘤細胞的AGPGshui平明顯高于正常細胞，ESCC細胞的AGPG拷貝數也增加（圖1c,d），AGPG在其他ESCC細胞系中對細胞增殖和分泌乳酸的作用也得到進(jìn)一步證實(shí)。

2 AGPG的表達與食管鱗癌預后的關(guān)系

與我們的生物信息學(xué)分析結果（圖1e）一致，我們發(fā)現高AGPGshui平與ESCC患者的不利總體生存率相關(guān)（圖1f）。與中值相比，我們將基因表達分為低表達或高表達：如果表達shui平高于中值，則將其分為高表達，而如果低于中值，則將其分為低表達。多因素分析也表明AGPG是ESCC患者的獨立預后因素。根據TCGA數據庫分析，AGPG在多種癌癥中高表達，包括胃癌（GC）、結直腸癌（CRC）、肝癌、乳腺癌和肺癌。但在多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）、頭頸部鱗狀細胞癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中，其表達與正常組織無(wú)明顯差異。此外，在腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌和腎乳頭狀細胞癌中，AGPGshui平也降低。與許多其他LncRNA類(lèi)似，AGPG在不同癌癥中具有組織特異性表達模式。接下來(lái)，我們進(jìn)行qRT-PCR和RNAScope原位雜交（ISH）檢測AGPG在ESCC、GC和CRC組織中的表達。我們的結果顯示AGPG在ESCC、GC和CRC組織中高度表達（圖1g-i）。這些結果提示AGPG的失調與癌癥的發(fā)展有著(zhù)密切的關(guān)系。為了確定AGPG的亞細胞定位，我們用qRT-PCR方法檢測了AGPG在胞質(zhì)和細胞核中的表達。結果表明，AGPG主要定位于細胞核，部分定位于細胞質(zhì)，RNAScope-ISH和RNA熒光原位雜交進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1j-l，補充圖1i）。

3 AGPG促進(jìn)細胞增殖和糖酵解

由于AGPG可能參與細胞增殖和乳酸生成，我們進(jìn)一步研究了AGPG在細胞行為中的功能作用。KYSE150和KYSE30細胞中的AGPG敲除顯著(zhù)抑制細胞增殖和菌落形成（圖2a-d），AGPG敲除阻斷G1/S細胞周期轉換（圖2e、f）。我們還檢測到了關(guān)鍵細胞周期蛋白，并觀(guān)察到AGPG基因敲除顯著(zhù)增加了p27的表達，降低了CDK1的表達（圖2g），但沒(méi)有改變p21、p53、CDK3或CDK6的表達。這些結果提示，AGPG可能通過(guò)調節p27等關(guān)鍵細胞周期蛋白和CDK1介導的G1/S進(jìn)程來(lái)促進(jìn)細胞增殖。為了驗證AGPG在代謝重編程中的作用，使用細胞外流量分析儀測量ESCC細胞的細胞外酸化率（ECAR）（圖2h，i），證明AGPG基因敲除顯著(zhù)損害糖酵解，這與我們之前的篩選結果一致。為了進(jìn)一步確定葡萄糖的代謝流量，我們檢測了¹³C₆葡萄糖孵育2 h后，ESCC細胞內¹³C標記的代謝中間產(chǎn)物的數量（圖2j）?；谝合嗌V和質(zhì)譜（MS）的代謝組分析表明，AGPG基因敲除后糖酵解的細胞內代謝物（3-磷酸甘油酸、丙酮酸和乳酸）明顯減少，進(jìn)一步證實(shí)AGPG對葡萄糖轉化為乳酸至關(guān)重要（圖2k-m）。為了進(jìn)一步確認AGPG的功能作用，我們使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統生成了AGPG-CRISPR-KO細胞，結果顯示AGPG CRISPR KO顯著(zhù)抑制ESCC細胞增殖和細胞周期進(jìn)展。綜上所述，我們的數據表明，AGPG在調節腫瘤代謝重編程和腫瘤生長(cháng)方面具有重要的功能。

4 AGPG與PFKFB3直接相關(guān)

為了剖析AGPG介導的代謝重塑的分子機制，我們嘗試通過(guò)RNA pull-down分析和質(zhì)譜分析來(lái)鑒定AGPG相關(guān)蛋白。通過(guò)比較AGPG結合蛋白和反義AGPG結合蛋白，發(fā)現非反義對照的sense-AGPG與PFKFB3（圖3a）有特異性的相互作用，如前所述，PFKFB3也主要位于細胞核內。通過(guò)發(fā)現AGPG直接結合到純化His標記的重組PFKFB3（圖3b）進(jìn)一步證實(shí)了這一觀(guān)察結果。AGPG和PFKFB3之間的相互作用也通過(guò)RNA免疫沉淀（RIP）分析得到證實(shí)（圖3c）。為了進(jìn)一步研究AGPG和PFKFB3在體內的相互作用，我們進(jìn)行了MTRAP和western blotting，與陰性對照組相比，MS2-AGPG和MCP-3FLAG質(zhì)粒的共表達導致PFKFB3顯著(zhù)富集，表明PFKFB3特異性地與AGPG結合（圖3d）。免疫熒光共聚焦分析表明，AGPG和PFKFB3主要在細胞核內共聚焦，在細胞質(zhì)內有部分共聚焦，提示AGPG-PFKFB3復合物可能在細胞核和細胞質(zhì)中都起作用（圖3e）。此外，我們用qPCR檢測AGPG的表達，用western blotting檢測PFKFB3在一組ESCC細胞、12對ESCC組織和匹配的正常食管組織（SYSUCC）中的表達。如所料，AGPG的表達與ESCC中PFKFB3的表達呈正相關(guān)（圖3f），這進(jìn)一步揭示了AGPG與PFKFB3之間的功能關(guān)系?？傊?，這些結果表明AGPG和PFKFB3是密切相關(guān)的，它們的相互作用在人類(lèi)癌癥的發(fā)展中起著(zhù)重要作用。

5 AGPG介導的T5片段與PFKFB3的相互作用

為了定位介導AGPG與PFKFB3相互作用的區域，我們使用體外合成的全長(cháng)（FL）AGPG和T1（1–800）、T2（801–1140）、T3（1141–1700）、T4（1701–2030）和T5（2031–2321）片段進(jìn)行RNA pull-down分析，然后通過(guò)western blotting分析產(chǎn)物。我們證明了T5片段可以與PFKFB3結合，而其他片段或珠狀對照不能結合。用純化的重組PFKFB3進(jìn)一步驗證了這些結果（圖3g）。我們還進(jìn)行了CLIP qPCR分析證明T5片段是負責結合PFKFB3的主要區域（圖3h）。刪除T5片段后，AGPG不能再與PFKFB3相互作用（圖3i）。AGPG FL的過(guò)表達足以防止AGPG敲除后觀(guān)察到的表型，包括糖酵解性重編程和細胞增殖（圖3j，k）。這些結果顯示，AGPG與PFKFB3相互作用和調節需要T5片段，而下游細胞過(guò)程可能是通過(guò)AGPG與PFKFB3相互作用介導的。為了進(jìn)一步確定與PFKFB3結合的特定基序，我們進(jìn)行了HITS-CLIP，在這些基序中，CCAGCCA或類(lèi)似的基序是高度排序的，可以通過(guò)多種方法識別。這些數據表明AGPG的CCAGCCA基序對其結合PFKFB3和促進(jìn)腫瘤糖酵解重編程的能力很重要。

6 AGPG阻斷APC/C介導的PFKFB3泛素化

由于PFKFB3含有一個(gè)激酶結構域和一個(gè)磷酸酶結構域，因此構建了三個(gè)含有FL（1-520）、N-末端（N，1-245）和C-末端（C 246-520）結構的帶有人類(lèi)標記的PFKFB3載體，以鑒定與AGPG相關(guān)的PFKFB3殘基。有趣的是，我們證明AGPG主要與C-末端片段相互作用，與N-末端片段的結合zui?。▓D4a）。然后，我們使用IgG對照進(jìn)行RIP分析。如所料，AGPG與PFKFB3的C末端片段一起沉淀（圖4b）。然后，我們評估了AGPG-PFKFB3相互作用對PFKFB3的功能影響。有趣的是，shRNA介導的AGPG基因敲除顯著(zhù)降低了PFKFB3的表達（圖4c），這也被CRISPR/Cas9證實(shí)在AGPG-CRISPR-KO細胞中（圖4d）。此外，過(guò)表達AGPG FL互補了AGPG缺失引起的PFKFB3shui平下降（圖4d）。這些數據表明AGPG可能通過(guò)T5片段調節PFKFB3蛋白shui平。并且蛋白酶體抑制劑MG-132恢復了PFKFB3shui平的降低（圖4e）。PFKFB3包含一個(gè)KEN盒，通過(guò)后期靶向蛋白質(zhì)泛素化測試，PFKFB3被證明受到涉及一種細胞周期調節的E3泛素連接酶APC/C-Cdh1的降解。因此，為了進(jìn)一步闡明AGPG阻斷PFKFB3泛素化的機制，我們使用PFKFB3和Cdc27抗體進(jìn)行coIP分析，以確定AGPG是否影響PFKFB3和活性APC/C之間的相互作用。結果顯示AGPG CRISPR KO顯著(zhù)增加了PFKFB3/Cdc27的相互作用（圖4h），提示AGPG可阻斷Cdc27與PFKFB3的結合。

7 AGPG是p53的轉錄靶點(diǎn)

由于AGPG在腫瘤中高表達，我們試圖確定AGPG的調節機制。通路分析表明AGPG表達與p53呈負相關(guān)（圖5a）。對不同TP53基因型的細胞的分析表明TP53 KO的HCT-116細胞的AGPGshui平高于對照細胞（圖5b），具有WT-TP53（KYSE150）的細胞表達的AGPGshui平遠低于含有突變株（MT）TP53（TE-1和KYSE30）24的細胞（圖5c）。KYSE150和HCT-116細胞中WT TP53的過(guò)度表達降低了AGPGshui平，而TP53的敲除增加了AGPG的表達，進(jìn)一步證實(shí)了p53在調節AGPG表達中的作用（圖5d）。此外，通過(guò)qPCR分析，AGPG表達shui平與WT-TP53的ESCC患者的TP53表達呈負相關(guān)（圖5e，SYSUCC，n = 72）。接下來(lái)，我們確定了p53介導的AGPG調控所需的區域，AGPG啟動(dòng)子包含p53結合序列（圖5f），該序列被識別為p53結合區（p53-BR）（圖5g）。且含有完整p53-BR（p53-BR-wt）的熒光素酶報告子的轉錄活性明顯弱于那些p53-BR缺失的報告子（p53-BR-mt）。此外，WT-TP53的共轉染選擇性地降低了具有完整p53-BR的報告者的轉錄活性（圖5h）?？傊?，我們的數據顯示p53在AGPG轉錄中的重要調節作用，TP53的丟失或突變導致AGPG的顯著(zhù)上調。包括缺氧、DNA損傷和癌基因表達等多個(gè)微環(huán)境因素下，我們研究了其參與的AGPG調控網(wǎng)絡(luò )（圖5i）。在293 T細胞中，癌基因KRasG12V的表達導致AGPG上調和TP53下調（圖5j），表明癌基因應激通過(guò)影響TP53狀態(tài)參與AGPG調控。我們還將我們的分析擴展到缺氧條件下，通過(guò)檢測暴露于嚴重缺氧或正常缺氧48小時(shí)的細胞中AGPG和TP53的表達。WT和MT p53均如先前報道的那樣上調；缺氧后，TP53細胞（KYSE150）中AGPG的表達降低，TP53細胞（TE-1和KYSE30）中AGPG的表達顯著(zhù)增加（圖5k）。這些結果表明，在WT-TP53存在下，缺氧誘導的AGPG上調可以被抑制。

8 AGPG對ESCC腫瘤生長(cháng)的影響

然后，我們探討了AGPG在體內腫瘤發(fā)生中的作用。AGPG基因敲除顯著(zhù)抑制了基于細胞的異種移植瘤生長(cháng)（圖6a-c）。如血黃素和曙紅（HE）和免疫組化（IHC）結果所示，AGPG基因敲除降低了細胞增殖標記Ki67的shui平，降低了PFKFB3和CDK1的shui平，但增加了p27的shui平（圖6d，e）；這些結果與我們的體外實(shí)驗結果一致，在患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型（使用來(lái)自?xún)蓚€(gè)ESCC患者的腫瘤組織生成，SYSUCC）（圖6f）中，通過(guò)體內優(yōu)化的AGPG抑制劑消耗AGPG顯著(zhù)降低腫瘤生長(cháng)（圖6g-i），表明AGPG是一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。PDX模型中使用的體內優(yōu)化AGPG抑制劑的主要成分是反義寡核苷酸，它對核定位RNAs28具有較強的敲除作用。因此，如HE和IHC分析所示，AGPG基因敲除顯著(zhù)影響細胞增殖（Ki67所示），這可能歸因于前面提到的PFKFB3和下游CDK1和p27表達的調節

9 p53-AGPG-PFKFB3軸參與ESCC的形成

為了確定p53-AGPG-PFKFB3是否與ESCC的發(fā)生有臨床關(guān)聯(lián)和病理關(guān)系，我們通過(guò)qPCR和Ki67檢測了AGPG的表達，通過(guò)IHC檢測了PFKFB3、CDK1、p27和p53的表達。AGPG高組Ki67、PFKFB3和CDK1表達較高，p27和p53表達較低，而AGPG低組則相反（圖7a、b）?？傊?，我們推測p53-AGPG-PFKFB3的失調促進(jìn)了ESCC的發(fā)展。與之前的報道一致，PFKFB3在惡性組織中高表達（圖7c，d），并且PFKFB3高表達與ESCC患者的不良預后相關(guān)（圖7e）。接下來(lái)我們通過(guò)RNAScope-ISH檢測AGPG在這些組織中的表達。然后，將組織分為AGPG/PFKFB3高組、AGPG/PFKFB3中間組和AGPG/PFKFB3低組，其中AGPG/PFKFB3高組的預后比其他組差得多（圖7f）。這些數據進(jìn)一步表明AGPG/PFKFB3是一個(gè)有前途的預后指標和潛在的治療靶點(diǎn)。