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線(xiàn)粒體是細胞代謝的重要介質(zhì)，是活性氧（ROS）的產(chǎn)生者和靶點(diǎn)，是ATP水平和鈣穩態(tài)的調節劑，也是參與氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸合成的生物合成途徑的樞紐。

線(xiàn)粒體存在于所有細胞中，它們的大小、形狀和數量不同，這取決于細胞、基礎組織和其他一些因素的代謝需求?？紤]到它們在細胞和機體功能中的關(guān)鍵作用，在許多遺傳和非遺傳疾病以及癌癥和衰老中觀(guān)察到線(xiàn)粒體（mt）功能障礙并不奇怪。在絕大多數情況下，mt功能障礙的顯著(zhù)特征包括mt膜電位（mtmP）、mt質(zhì)量和氧化還原電位的變化。

流式細胞儀可以快速監測完整細胞中的所有這些參數，避免mt分離和/或破膜造成的假象?，F在已經(jīng)有許多mt特異性熒光探針，可用于測量mtmP、mt質(zhì)量和mt內ROS，見(jiàn)下表：

線(xiàn)粒體膜電位檢測原理和要點(diǎn)

mtmP是質(zhì)子運動(dòng)動(dòng)力的主要組成部分，它是由mt基質(zhì)泵到膜間空間的質(zhì)子形成的。這種電位根據線(xiàn)粒體的狀態(tài)而變化，與它們合成ATP的能力有關(guān)，是細胞健康的常見(jiàn)指標。mt基質(zhì)是負電位的，因此用于測量mtmP的染料通常是親脂性陽(yáng)離子化合物，即帶正電荷的分子，它們可以跨膜而不會(huì )與膜結合，并與mtmP成正比地積聚在mt基質(zhì)中。超極化線(xiàn)粒體能積聚更多的染料，而去極化線(xiàn)粒體積聚的染料較少。

通過(guò)流式細胞術(shù)評估mtmP時(shí)，必須考慮兩個(gè)要點(diǎn)：

首先，應仔細滴定染料濃度。高染料濃度會(huì )導致熒光猝滅，從而產(chǎn)生結果異常。雖然淬滅閾值因染料而異，但一般1–30 nM的濃度算足夠低，大多能避免不必要的淬滅現象。

其次，必須使用功能性對照來(lái)確保染料信號的變化能得到正確解讀，避免非特異性改變。合適的對照包括：

1.作為解偶聯(lián)劑的FCCP、CCCP和valinomycin，誘導去極化。2.oligomycin，一種ATP合成酶抑制劑，誘導去極化。3.nigericin，K＋/H＋離子載體，誘導超極化。

不同線(xiàn)粒體膜電位染料優(yōu)缺點(diǎn)

DiOC6已廣泛用于流式細胞術(shù)研究中，但是，DiOC6作為NADH抑制劑的活性，以及對mt的毒性，強烈限制了該探針的使用。

與DiOC6相似，羅丹明123（Rh123）初用于不少研究，不過(guò)Rh123雖然容易進(jìn)入細胞并迅速達到平衡，但不能很好地保留在里面。此外，在某些情況下，Rh123與線(xiàn)粒體的結合可能與線(xiàn)粒體能量狀態(tài)無(wú)關(guān)，這進(jìn)一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯（TMRE）和四甲基若丹明甲酯（TMRM）也被廣泛用于流式細胞術(shù)檢測mtmP，這些染料無(wú)毒，染色后不易淬滅，但應以相對較低的濃度使用，可以在染色后立即進(jìn)行分析，無(wú)需洗滌。這兩種染料激發(fā)光均為488nm，發(fā)射波長(cháng)574nm發(fā)射。通常，應準備未染色的樣品（也稱(chēng)為“空白樣品”），以設置背景熒光的水平。因此，通過(guò)TMRE或TMRM分析mtmP的變化時(shí)，就被定義為給定樣品的MdFI的變化。

碳花青染料，尤其是JC-1被認為是檢測mtmP的可靠探針。JC-1具有多色熒光發(fā)射光譜，并允許對mt去極化進(jìn)行比例式半定量評估。在單體狀態(tài)下，它發(fā)出綠色熒光（529 nm），而在高度依賴(lài)于mtmP的聚集狀態(tài)下，它發(fā)出橙紅色熒光（> 590 nm），在化合物誘導mtmP崩潰時(shí)，JC-1也會(huì )成為單體。這意味著(zhù)，在健康細胞中，可以出現少量綠色，大多數為橙紅色熒光，線(xiàn)粒體去極化的細胞大多僅顯示綠色熒光?？紤]到由于mtmP變化引起的熒光變化，顯示結果的j方法是指示mtmP高或低的細胞百分比，而不是綠色和橙紅色熒光之間的比率。

自1993年以來(lái)，據報道，JC-1是幾種細胞類(lèi)型和測定條件的可靠膜電位指示劑，并且其與其他熒光探針的兼容性也已在多色方案中得到了證明。但是，JC-1對過(guò)氧化氫敏感、光敏感以及單體與聚集體形式之間的平衡速度較慢，可能會(huì )在一定程度上限制其使用。其它類(lèi)似于JC-1的還有JC-9和JC-10，JC-9的單體或聚集體形式在522 nm激發(fā)，分別以535或635 nm發(fā)射。JC-10在490 nm激發(fā)，并在520 nm（單體形式）或590 nm（聚集形式）發(fā)射。

線(xiàn)粒體質(zhì)量檢測染料

線(xiàn)粒體質(zhì)量可通過(guò)使用能夠結合特定mt成分的染料進(jìn)行監測，而與mt極化狀態(tài)無(wú)關(guān)。因此，熒光量與mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange（NAO）這兩種染料能與mt內膜的cardiolipin結合，而MitoTracker染料與mt蛋白中存在的半胱氨酸殘基的巰基反應。其中一些染料，包括MitoTracker deep red 633，也與mt蛋白形成共價(jià)鍵，因此在細胞染色后可以固定。與TMRE和TMRM類(lèi)似的是，對于MitoTracker染料，應測量MdFI的變化。

線(xiàn)粒體ROS檢測染料

關(guān)于mt ROS，近開(kāi)發(fā)了兩種熒光探針，分別是MitoSOX和mi，以分別標記線(xiàn)粒體中的陰離子超氧化物和過(guò)氧化氫。

MitoSOX是氫乙啶化合物，可靶向定位到線(xiàn)粒體，依賴(lài)mtmP積累到線(xiàn)粒體中，氧化后與線(xiàn)粒體DNA結合后發(fā)出熒光。與其他探針類(lèi)似，當使用MitoSOX和mi時(shí)，必須準備足夠的陽(yáng)性和陰性對照全面驗證生物系統中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j陽(yáng)性對照，而外源H2O2則是mi的正確陽(yáng)性對照。MitoSOX染色的陰性對照是細胞可滲透的超氧化物歧化酶模擬物或mt解偶聯(lián)劑，具體取決于細胞類(lèi)型。對照的其它制備形式也可以用抗氧化劑來(lái)處理，例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大減少自由基產(chǎn)生的特異性清除劑。

目前已有不少文獻通過(guò)流式細胞術(shù)對MitoSOX和mi進(jìn)行了測試，能選擇性定量角質(zhì)形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞和幾種癌細胞系中的mt陰離子超氧化物和mt過(guò)氧化氫，也有報道可能在同一細胞中同時(shí)使用MitoSOX和mi來(lái)分析活細胞中的mt ROS。