讓細胞培養不再為難新手

                                                                       作者：畢老師 

細胞培養起初對于我這種“女漢子”性格的人來(lái)說(shuō)，著(zhù)實(shí)是枯燥的工作，因為面對的細胞， 它不會(huì )說(shuō)話(huà)不會(huì )笑不能對你有任何回應，而且對于喜歡外科喜歡拿刀的我來(lái)說(shuō)，細胞培養更 像是個(gè)內科醫生做的事情，每天換液就如同換藥，它污染了就需要上各種抗生素來(lái)“搶救” 它。。。。。?？墒请S著(zhù)一天天的相處，一天天的用心體會(huì )，我漸漸發(fā)現原來(lái)細胞培養也是一項
十分有意思的工作，下面將我的一些經(jīng)驗分享給大家。 
 
換液： 
 
從培養箱中取出培養瓶； 
 
用吸液管將瓶的廢液全部吸出（在培養瓶的左下角吸走液體，勿接觸細胞），吸管丟棄。 
 
更新吸液管，從培養液貯存管中吸取新培養液，加入培養瓶，注意哦，千萬(wàn)不要直接沖洗細
胞，細胞們都嬌滴滴的，容不得半點(diǎn)“風(fēng)吹雨打”。吸出廢液至加入新液之間一般不超過(guò) 5-10 秒鐘，以免細胞因干燥而死亡。 
 
保留該吸管（節省一根是一根），用于吸取下一輪需要換液的同源細胞的廢液，注意一定是
廢液。 （同源細胞、無(wú)污染的幾個(gè)培養瓶可用同一根吸管吸走或加入培養液。） 
 
  先換生長(cháng)速度慢的細胞，再換生長(cháng)速度快的（這似乎和我們平時(shí)“早起的鳥(niǎo)有蟲(chóng)吃”的原 則不同，長(cháng)得快的要后吃飯，嘿嘿）；先換無(wú)污染的，再換有污染的。 

微生物污染處理： 
 
  每天到實(shí)驗室，肯定是看我的“心肝寶貝兒”——細胞，害怕的事情莫過(guò)于 發(fā)現細胞污染了，那種心情就像母親每天醒來(lái)看自己的孩子，結果發(fā)現孩子生病了一樣焦急
難過(guò)。如何發(fā)現細胞污染呢？首先要在取出細胞后，先觀(guān)察一下培養液的顏色，如果培養液 都能看出污染了，那這個(gè)細胞基本就無(wú)藥可救了。 
 
  培養液肉眼看著(zhù)正常，細胞就一定正常嗎？答案是否定的。關(guān)鍵的還是要通過(guò)我們的
*神器——顯微鏡來(lái)觀(guān)察，下面給大家看一些細胞污染的圖片： 

  有微生物污染的一般均丟棄。如污染不嚴重而該細胞株較重要，則可試行治療如下：盡
量吸凈原培養液裝在有蓋的小瓶子里，蓋好；用過(guò)吸管放桌下收集有污染物品的盒子里；用
Hanks 液或培養液洗滌 2 次（環(huán)形搖晃幾周，再將液體吸走，放在有蓋的瓶子里）；加入抗生
素。如為霉菌污染，則加抗霉菌素—兩性霉素 B（Fugzone）終末濃度為 2.5 ug/ml。預防量減
半。 

  細胞污染不于細菌等微生物，當同時(shí)培養多種細胞，細胞與細胞間也會(huì )發(fā)生交叉污
染，這個(gè)時(shí)候我們可以用遺傳霉素（Geneticin）終末濃度 100 ug/ml，如保存液為 1:30，則
在培養瓶/皿中每 3 ml 培養液加 0.1 ml Geneticin。 
 
單純傳代步驟： 
 
以 25 cm2 培養瓶（6 ml）為例，用 5 ml 吸管將原培養液吸出； 
 
用 2 ml 吸管吸取 D-Hanks 液 2 ml（12.5 cm2 培養瓶和 6 皿板用 1 ml）加入培養瓶，以洗清
血清，輕晃幾次后吸出； 
 
用 2 ml 吸管吸加 TE 1/2（Trypsin 0.025% + EDTA 0.01%）2 ml，輕晃使之到達每個(gè)角落（一定
要照顧到各個(gè)角落啊，即使是冷宮的細胞娘娘也要照顧到），放入 37 °C 水浴，使貼皿細胞脫
落。 
觀(guān)察時(shí)見(jiàn)細胞基本浮起，用 2 ml 吸管加 0.2 ml 血清中和，吸出瓶中的液體及細胞（即 2.2 
ml）。如按照 1:4 稀釋傳代，則 0.5 ml 傳代（1.5 ml 保存或丟棄）加至 15 ml 離心管。該吸管
可保留再用。 

取等量的離心管作配對，進(jìn)行離心（5 分鐘，標記 60 處，即 1000-1500 轉/分）； 
 
離心后用上一步驟保留的吸管將離心管中的上清液吸走；換一根 5 ml 吸管，吸取 6.5 ml 培
養液，加 5.5 ml 至培養瓶（12.5 cm2 培養瓶則吸取 4.0 ml 培養液，加 3 ml 至培養瓶），加 1 
ml 至離心管，用巴氏管適度吹打 5 次，全部吸出，水平橫持巴氏管滴入培養瓶，保留 1-2 滴
加入血球計數板作計數。 
 
將培養瓶置于培養箱。 
 
  以上都是常規的操作，也是每個(gè)科研狗每天都要面對的工作，貌似枯燥無(wú)味，實(shí)則妙趣
橫生，只要用心你會(huì )發(fā)現其實(shí)別有洞天。