（sCD14）ELISA試劑盒

實(shí)驗原理： 本（sCD14）ELISA試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬白細胞介素 6（IL-6）水平。用純化的豬白細 胞介素 6（IL-6）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入豬白細胞 介素 6（IL-6），再與 HRP 標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬白細胞介素 6（IL-6）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長(cháng) 下測定吸光度（OD 值），通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中豬白細胞介素 6（IL-6）含量。 （sCD14）ELISA試劑盒組成請聯(lián)系公司技術(shù)小葉 

樣本處理及要求： 

1.血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集 上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應該再次 離心。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程 中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉 /分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞 濃度達到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分 鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。 

5. 組織標本：切割標本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備 用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將 標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢 測，其余冷凍備用。 

6. 標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上 進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟 

1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣 品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl （樣品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃 動(dòng)混勻。 

3. 加酶：每孔加入酶標試劑 100μl，空白孔除外。 

4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。 

5. 配液：將 20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。 

7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯 色 15 分鐘。

8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。 

9. 測定：以空白孔調零，450nm 波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 

測定應在加終止液 后 15 分鐘以?xún)冗M(jìn)行。 

注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開(kāi)封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結果。 

3． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間 控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 

4． 請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計 算時(shí)請后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 

6． 底物請避光保存。 

7． 嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 

9． 本試劑不同批號組分不得混用。 

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準。 

計算： 以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的 OD 值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。 試劑盒性能： 1.樣品線(xiàn)性回歸與預期濃度相關(guān)系數 R 值為 0.95 以上。 2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于 10%和 10% 。 檢測范圍： 25 pg/mL - 800 pg/mL 靈敏度： 低檢測濃度小于 1.0 pg/mL 保存條件及有效期： 1.試劑盒保存： 2-8℃。