小鼠胚胎成纖細胞

小鼠胚胎成纖細胞細胞培養步驟

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備DMEM（iCell-128-0001）培養；小牛血清，10%；Glutamax，1%；NEAA(Non-essential Amino Acids)，1%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

注意事項：

1. 該細胞起始接種密度應在3000/平方厘米，并且在細胞達到80%融合或者密度介于5萬(wàn)-6萬(wàn)/平方厘米時(shí)傳代，避免細胞*融合。

2. 冷凍細胞在復蘇后有些漂浮的細胞有可能是存活的，應通過(guò)溫和離心收集并繼續培養。

3. 細胞內空泡通常是細胞受到壓力的表現，原因可能是培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌劑、不適當的CO2環(huán)境對培養基中碳酸氫鈉濃度或培養基的營(yíng)養消耗殆盡。一般來(lái)說(shuō)，對于某些細胞系，尤其是向3T3-L1這樣具有脂滴的細胞，細胞包含空泡是正常的。

4. 大部分品牌的DMEM含有較高濃度的碳酸氫鈉（3.7g/L），培養細胞時(shí)需要提高CO2濃度（7%-10%）。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過(guò)夜（或將細胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養基，培養過(guò)夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養。

小鼠胚胎成纖細胞對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加2ml*培養基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4 . 收到細胞后*傳代推薦將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中，建議客戶(hù)凍存一支備用，后續傳代根據實(shí)際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。

3）細胞凍存：待細胞生長(cháng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

1．細胞凍存時(shí)，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml*培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

2．1000rpm離心4min去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個(gè)凍存管細胞數目大于1X106個(gè)細胞凍存。

3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。