熒光定量技術(shù)已經(jīng)很普遍，但對于接觸它的人來(lái)說(shuō)，總會(huì )遇到一些這樣那樣大大小小的問(wèn)題，這些熒光定量實(shí)驗中（染料法）的一些小技巧，相信你能用得上，助在PCR的路上一帆風(fēng)順，少走彎路。

　　熒光定量是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

　　熒光定量是實(shí)驗室常用的實(shí)驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。

　　熒光定量的引物設計原則：

　?。?）引物長(cháng)度一般在15~30堿基之間，過(guò)長(cháng)會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應。

　?。?）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值。

　?。?）引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗了。

　?。?）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會(huì )折疊成發(fā)夾結構使引物本身復性。

　?。?）引物擴增長(cháng)度：一般RT-PCR引物擴增長(cháng)度在100-200bp。