原代人類(lèi)肝細胞(PHH)體外培養模型人類(lèi)肝臟功能，可以產(chǎn)生與真實(shí)體內藥物代謝非常相似的代謝譜。而PHH培養是研究體外肝細胞生物學(xué)、肝功能和藥物誘導肝毒性的金標準，但常規的2D水平 PHH培養由于受到去分化和肝特異性功能迅速喪失的限制，所以我們需要尋求一種更穩定的體外模型構建方法，從而能夠真實(shí)反映體內肝臟結構及功能，并具有更好的有效培養時(shí)長(cháng)。

研究PHH細胞球模型在長(cháng)時(shí)間培養、白蛋白分泌、CYP3A4活性分析、包括是否可以維持肝細胞特異性功能如ATP合成等方面進(jìn)行了綜合分析，數據均表明其在長(cháng)時(shí)間培養期間是穩定的。另外在第5、7、14和第21天的基因表達譜分析中，白蛋白和CYP3A4等肝細胞特異性基因的表達量均高于2D培養組。在此基礎上，通過(guò)兩種藥物完成了藥物誘導毒性的肝損傷模型建立和相關(guān)功能驗證。

這些結果表明，PHH 3D模型系統是一種很有前途的體外肝功能評估體系作，為我們未來(lái)工作的一部分，研究項目正在積j引入非實(shí)質(zhì)肝細胞如Kupffer細胞和從星型細胞構建3D模型，以評估和拓展各種肝臟疾病模型構建的可行性。

圖1-A PHH 3D細胞球構建流程（培養5天或者更少的時(shí)間趨于穩定）

圖1-B PHH 3D細胞球模型在Nunclon™ Sphera 96孔U底板中呈現穩定均一的狀態(tài)

圖2 PHH 3D 細胞球驗證，右圖為構建成功的3D模型

原代肝細胞球特點(diǎn)：

1- 穩定培養時(shí)間較長(cháng)（2D培養時(shí)長(cháng)4~6天 vs 3D Spheroids 培養時(shí)長(cháng)為數周）

2- 肝細胞球中CYP3A4活躍程度較高

3- 肝細胞球中蛋白及基因表達高度接近體內表達水平

注：并不是所有的培養細胞均能成球形，需要進(jìn)一步驗證

圖3 基于培養耗材的3D 模型驗證

上圖分別對比了Nunc™Sphera™U型底96孔板和其它聚苯乙烯類(lèi)培養容器，Nunc板材因其具有的超低細胞吸附力而促進(jìn)了細胞球以及類(lèi)器官的長(cháng)期穩定培養。

圖4-A PHH 3D細胞球相較2D培養，白蛋白及CYP3A4基因表達水平均呈現一致性高表達

圖4-B PHH 3D細胞球相較2D培養，CYP3A4活性均呈現高水平

圖5 PHH 3D細胞球相較2D培養特異性敏感度較高，同時(shí)對兩種藥物毒性誘導結果進(jìn)行分析，3D模型IC50分析更加接近于體內代謝水平

圖6 肝內膽管細胞球模型評估

通過(guò)Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7高內涵平臺對培養14天的HepG2細胞球（左圖）和培養7天PHH細胞球（右圖）進(jìn)行高通量圖像采集及評估（CFDA\DAPI標記，10x物鏡），PHH肝膽管細胞球模型呈現更加清晰的結構。

圖7-A 細胞球大小及ATP產(chǎn)量與接種細胞數量成正比

（圖中顯示每孔接種1500個(gè)細胞的成球狀態(tài)更加均一和穩定，約200µm的直徑）

圖7-B 上圖顯示細胞接種數量和ATP產(chǎn)量呈正比關(guān)系

本研究提供的數據明確顯示，經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養的PHH細胞球模型可以保持至少在21天內表現為穩定的形態(tài)維持、較高的活力和保持肝細胞特異性功能等特征。同時(shí)圖6也充分顯示肝膽管模型的成功構建并且可以保持較好的肝細胞特異性功能和穩態(tài)，且有持續的白蛋白表達。在充分驗證PHH 3D細胞球可保持較高的活性基礎上，可以開(kāi)展藥物誘導的細胞毒性研究，在保持較長(cháng)培養時(shí)長(cháng)和優(yōu)化細胞用量的同時(shí)，更好地開(kāi)展肝細胞功能的高通量藥物篩選和持續性研究。

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