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Caco-2 細胞轉運模型一點(diǎn)小事

更新時(shí)間:2020-03-11瀏覽:2325次

                                 想研究藥物口服吸收?Caco-2 細胞模型來(lái)

作者:葉軍 

Caco-2 細胞轉運模型是被國外制藥企業(yè)以及實(shí)驗室應用的模擬腸道吸收的藥物篩選模 型,已廣泛應用于藥物在小腸吸收的評價(jià)和轉運機制研究中。Caco-2 細胞的結構和功能類(lèi)似 于人小腸上皮細胞,含有與小腸刷狀邊緣上皮相關(guān)的酶系。 

與正常的成熟小腸上皮細胞在體外培育過(guò)程中出現的逆向分化不同,Caco-2 細胞在多孔可滲 透的聚碳酸酯膜上培養 3 周后可以自發(fā)分化為腸上皮細胞,形成致密的細胞單層,進(jìn)而可用 作腸道轉運模型(圖 1)。 Caco-2 細胞模型培養和驗證方法簡(jiǎn)單,與體內動(dòng)物實(shí)驗相比更為 方便、經(jīng)濟。 

 

1. Caco-2 細胞培養 

1) 采用 MEM *培養液(含 10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺 和 1%青-鏈霉素)在 37℃和 5% CO2 條件下培養 Caco-2 細胞; 

2) 每隔一天更換一次培養液。當細胞匯合程度達 80%時(shí),進(jìn)行細胞傳代。將細胞培養液吸

出,用不含 Ca 2+和 Mg2+離子的 HBSS 小心清洗 2 次,加入 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混

合消化液進(jìn)行消化; 

3) 取細胞適量接種到 75 cm

2 培養瓶繼續培養或進(jìn)行鋪板操作。 

2. Caco-2 細胞模型的構建及驗證 

1) 收集對數期的 Caco-2 細胞,用 MEM *培養液將細胞濃度調整為 2.0×10

5 cells/mL; 

2) 在 Transwell 板(聚碳酸酯膜,0.4 µm,1.12 cm 2)(圖 2)的基底側(Basolateral side)加

入 1.5 mLMEM *培養液,在頂側(Apical side)加入細胞懸液 0.5 mL; 

3) 放入細胞培養箱內培養,每?jì)商鞊Q一次培養液,培養一周后每日換液; 

4) 繼續培養至 21 天; 

5) 采用 Millicell ERS 電阻儀(Millipore 公司)測定跨上皮細胞電阻(大于 500 Ω•cm 2), 確定

細胞單層的致密性和完整性。 

3. 轉運研究 

下面以熒光標記的藥物為例,借助激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀(guān)察藥物跨膜轉運(圖 3)。 

1) 取出 Transwell 板進(jìn)行電阻測定,選擇符合轉運條件的細胞孔(電阻大于 500 Ω•cm 2)。 用

預熱(37℃)的 Hank’s 緩沖液洗 2~3 遍,并置 37℃孵育平衡 20~30 min,吸棄洗液; 

2) 分別取 0.5 mL 熒光標記的藥物溶液加入頂側(Apical side)作為供給液,同時(shí)基底側 (Basolateral side)加入 1.5 mL 空白 Hank’s 緩沖液作為接收液; 

3) 37℃條件下轉運 2 h; 

4) 轉運結束后移除孔內熒光液,加 HBSS 小心清洗 3 次,洗去未進(jìn)入細胞的熒光染料結束轉 運;孔內加適量 4%多聚甲醛溶液,室溫下固定 20 min; 

5) 固定完成后用 HBSS 清洗 3 次,加 10 μg/mL Hoechst 33258 適量,室溫下染核 1 h;HBSS 清洗 3 次后,加 2 滴抗熒光淬滅劑,小心將單層細胞剪下至玻底小皿中,在激光共聚焦顯微 鏡下進(jìn)行 Z 軸橫切,觀(guān)察熒光標記藥物的跨膜過(guò)程。 

由激光共聚焦顯微鏡拍攝的圖可以看出,帶綠色熒光的藥物A與帶紅色熒光的藥物B在Caco2 細胞模型中的跨膜轉運速率不同,其中藥物 A 的跨膜轉運速率慢于藥物 B,跨膜轉運速率 的不同與藥物本身的理化性質(zhì)密切相關(guān)。 

除采用熒光標記的藥物進(jìn)行跨膜轉運研究外,還可以采用非熒光標記的藥物進(jìn)行跨膜研究,

此時(shí)測定藥物的跨膜轉運能力就需要借助其他檢測方式來(lái)(如高效液相色譜)完成。 

 

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