小鼠骨髓與骨內膜間充質(zhì)干細胞分析
Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells   

摘要：骨髓間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal Stromal Cells，MSCs) 是骨髓中具有自我更新能力，和成骨、成軟骨和成脂肪多向分化潛能的成體干細胞。MSC具有在體外形成纖維細胞集落 (CFU-F) 和在體內、外分化為骨、軟骨和脂肪細胞的能力。本文以小鼠骨髓組織為例，使用5種一抗和1種二抗，介紹在骨髓腔和骨內膜分離、標記MSC的方法，用此法標記的MSCs還可進(jìn)行細胞周期、凋亡等實(shí)驗。

材料與試劑

1. 15 ml離心管
2. 1.5 ml EP管
3. 70 μm濾膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
4. 小鼠 (C57BL/6J，6~8周齡，雄雌各半)
5. 胎牛血清 (FBS, Gibco, catalog number: 10100147)
6. Liberase (Roche, catalog number: 5401020001)
7. DNaseI (Roche, catalog number: 10104159001)
8. 流式抗體如下表1

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       同型對照抗體如下表 2

1. 磷酸緩沖液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
2. 氯化銨 (天津大茂化學(xué)，catalog number: 12125-02-9)
3. 碳酸氫鈉 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761，500G)
4. EDTA粉末 (鼎國，catalog number: LE568)
5. 7-AAD (Biolegend, catalog number: 420404, 50 µg/ml)
6. HBSS (Corning, catalog number: 26616008)
7. MSC消化酶 (見(jiàn)溶液配方)
8. 磷酸緩沖液 (1x PBS) (見(jiàn)溶液配方)   
9. 9.紅細胞裂解液 (500 ml) (見(jiàn)溶液配方)

儀器設備

1. 離心機 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
2. 移液器
3. 水浴鍋
4. 恒溫搖床
5. 搖床
6. 流式細胞儀 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)    

實(shí)驗步驟

1. 37 °C水浴預熱MSC消化酶 (配制方法見(jiàn)“溶液配方”部分)，37 °C預熱搖床，冰上預冷PBS + 2% FBS。
2. 頸椎脫臼處死小鼠，從下腹部剪開(kāi)小鼠腿部皮膚，小心剪開(kāi)髖關(guān)節與踝關(guān)節，將小鼠腿部完整取出，分離肌肉，取出股骨與脛骨，浸泡在預冷的PBS + 2% FBS中，置于冰上。 
3. 骨髓、骨內膜MSC取材

   3.1

   骨髓MSC取材：小心沿骨骺剪開(kāi)松質(zhì)骨部分 (圖1，沿虛線(xiàn)部分剪開(kāi))，用1 ml注射器吸取0.5 ml預冷的PBS + 2% FBS，將骨髓組織完整沖出至1.5 ml EP管中，1條股骨與1條脛骨骨髓置于同一個(gè)EP管中，冰上靜置5 min，吸去多余PBS。每管骨髓組織加入750 μl預熱的MSC消化酶，輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min，期間拿起顛倒數次。

   2

   骨內膜MSC取材：沖出骨髓后剩下的1條股骨與1條脛骨骨組織置于PBS + 2% FBS中，仔細剪碎骨組織，剪碎至骨髓腔*暴露，且碎片面積小于5 mm2 (圖2)，將骨組織置于750 μl預熱的MSC消化酶中，輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min，期間拿起顛倒數次。

4. 將上述骨髓組織或骨組織與消化酶的混合物側放于37 °C 160~220 rpm搖床中，消化20 min。
5. 消化后室溫靜置5 min，取上清約700 μl消化液加入至10 ml預冷PBS + 2% FBS進(jìn)行中和，注意不要吸取未消化的骨髓組織。
6. 骨髓組織或骨組織中再加入750 μl預熱的MSC消化酶，重復第4、5步進(jìn)行第2次消化，消化后盡量吸凈消化液，加入至第5步的中和后消化液中。
7. 將2次消化后的中和后消化液于4 °C 500 x g離心5 min，棄去上清，每管加入1 ml紅細胞裂解液，重懸骨髓組織，用移液槍輕柔吹打均勻，37 °C靜置5 min后加入10 ml的預冷的PBS + 2% FBS終止裂解，每管細胞準備1個(gè)新的50 ml離心管，將1個(gè)70 μm濾器置于離心管上，將上述終止裂解后的11 ml細胞懸液分次傾倒至濾器中，過(guò)濾至50 ml離心管中。4 °C 500 x g離心5 min，棄去上清。
8. 用適當體積預冷的PBS + 2% FBS重懸沉淀，用細胞計數板或流式細胞儀進(jìn)行細胞計數。
9. 取3份3 × 106細胞，調整至150 μl體積，加入2 μl (0.5 mg/ml) Purified CD16/32，置于冰上、80 rpm搖床上封閉30 min。
10. 其中1份細胞封閉后各加入1 μl以下抗體：Ter-119-APC，CD45-APC，Pdgfrα-SuperBright 436，LepR-biotin，加入0.2 μl CD31-PE/Cy7；1份細胞封閉后加入1 μl以下抗體：Ter-119-APC-iso，CD45-APC-iso，Pdgfrα-SuperBright 436，LepR-biotin; 另1份細胞封閉后加入1 μl以下抗體：Ter-119-APC，CD45-APC，Pdgfrα-SuperBright 436-iso，LepR-biotin-iso。以上3份細胞避光置于冰上、80 rpm搖床上孵育1 h。
11. 分別加入1 ml PBS + 2% FBS終止染色，500 x g離心5 min，棄去上清，150 μl預冷的PBS + 2%FBS重懸，加入1 μl (0.2 mg/ml) Streptavidin- APC/Cy7，置于冰上、80 rpm搖床上孵育30 min。
12. 分別加入1 ml PBS + 2% FBS終止染色，500 x g離心5 min，棄去上清，400 μl預冷的PBS + 2% FBS重懸，每管加入5 μl (50 µg/ml) 7-AAD，混勻后使用流式細胞儀收集數據。

       結果與分析

小鼠骨髓MSCs在Pdgfrα+和LepR+的細胞中富集，也有部分骨髓來(lái)源的MSC表達CD51，并且上述3個(gè)標記物有較高的共表達比例 (Morikawa等，2009; Zhou等，2014; Yue等，2016)。還有報道發(fā)現，Nestin-GFP (Mendez-Ferrer等，2010)，Gli1-cre (Zhao等，2014; Schneider等，2017)，Gremlin 1 (Worthley等，2015) 和N-cadherin (Zhao等，2019) 可富集骨髓MSCs，但這些分子標記物需要依賴(lài)熒光報告工具小鼠，故在此不介紹具體方法。在此，我們使用的小鼠骨髓和骨內膜間充質(zhì)干細胞的標志為CD45-Ter-119- CD31- LepR+或CD45- Ter-119-CD31- Pdgfrα+ 。圖3為同型對照的結果及劃門(mén)標準，圖4和圖5分別為骨髓和骨內膜間充質(zhì)干細胞分析流式圖和劃門(mén)方法。首先以FSC-A 和SSC-A 為軸，劃出主要細胞群，然后以FSC-A 和FSC-H去除黏連細胞，劃出單個(gè)細胞群，再根據7-AAD劃出活細胞群(7-AAD-)。接下來(lái)根據實(shí)驗需要劃出CD45- Ter-119- CD31- LepR+和CD45- Ter-119- CD31- Pdgfrα+細胞群，由流式結果可以得出，在骨髓和骨內膜MSC中LepR和Pdgfrα均有較高的共表達比例。

圖1. 小鼠股骨 (左)與脛骨 (右)，虛線(xiàn)表示剪開(kāi)的地方

圖2. 骨內膜MSC取材示意圖

圖3. LepR 與Pdgfrα同型對照結果及劃門(mén)標準

圖4. 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分析流式圖

圖5. 小鼠骨內膜間充質(zhì)干細胞分析流式圖

失敗經(jīng)驗

骨髓組織未被消化：

1. 消化酶活性喪失。
   *MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存，盡快使用。
2. 消化未在37 °C 160~220 rpm搖床中進(jìn)行。
   *需保證震蕩的轉速達160~220 rpm及消化時(shí)溫度維持至37 °C。

   無(wú)明顯MSC分群：

3. 消化過(guò)度或不足。
   *適當調整消化時(shí)間，消化骨髓組織時(shí)消化至沒(méi)有肉眼可見(jiàn)骨髓組織為宜。
4. 消化酶活性不足。
   *Liberase干粉-20 °C冰箱保存，MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存，盡快使用。
   *MSC消化酶使用前需在37 °C先預熱，加入骨髓組織后先在37 °C水浴鍋中孵育10 min，搖床需提前設定37 °C，保證震蕩消化時(shí)溫度維持至37 °C。
5. DNaseI 未添加或濃度不夠。
   *DNaseI的作用為消化細胞破裂后釋放的游離DNA，過(guò)多的游離DNA會(huì )纏繞細胞，導致消化不充分。但不同批號DNaseI的質(zhì)量與活性單位的換算比例不同，此處使用Roche公司DNaseI (10104159001)。
6. 使用了無(wú)鈣離子的HBSS。
   *DNaseI 需在鈣離子存在下發(fā)揮消化作用，故需使用添加了鈣離子的HBSS。
7. 一抗或二抗濃度過(guò)低。
   *適當提高抗體濃度。
8. 抗體孵育時(shí)間過(guò)短。
   *適當延長(cháng)孵育時(shí)間。
9. 置于室溫孵育。
   *置于室溫孵育易導致非特異結合增加，應置于冰上搖床孵育。
10. 置于4 °C冰箱靜置孵育。
    *應在約80 rpm搖床中孵育。

溶液配方

1. MSC消化酶
   Liberase 5 mg
   DNaseI 250 μl (20 mg/ml) 溶于25 ml HBSS
   -20 °C保存
2. 磷酸緩沖液 (1x PBS)
   使用去離子水稀釋PBS (10x) (去除鈣、鎂離子) 至1x
3. 紅細胞裂解液 (500 ml)
   氯化銨4.15 g
   碳酸氫鈉500 mg
   EDTA (粉末)18.5 mg
   使用去離子水定容至500 ml，4 °C保存

參考文獻

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   Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

   引用格式：謝嘉怡, 王瑨, 趙萌. (2019). 小鼠骨髓與骨內膜間充質(zhì)干細胞分析. Bio-101: e1010338. DOI:10.21769/BioProtoc.1010338.
   How to cite: Xie, J. Y. Wang，J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells. Bio-101: e1010338. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010338.