服務(wù)熱線(xiàn)
020-86438890
摘要:骨髓間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal Stromal Cells,MSCs) 是骨髓中具有自我更新能力,和成骨、成軟骨和成脂肪多向分化潛能的成體干細胞。MSC具有在體外形成纖維細胞集落 (CFU-F) 和在體內、外分化為骨、軟骨和脂肪細胞的能力。本文以小鼠骨髓組織為例,使用5種一抗和1種二抗,介紹在骨髓腔和骨內膜分離、標記MSC的方法,用此法標記的MSCs還可進(jìn)行細胞周期、凋亡等實(shí)驗。
材料與試劑
?
同型對照抗體如下表 2
儀器設備
實(shí)驗步驟
3.1
骨髓MSC取材:小心沿骨骺剪開(kāi)松質(zhì)骨部分 (圖1,沿虛線(xiàn)部分剪開(kāi)),用1 ml注射器吸取0.5 ml預冷的PBS + 2% FBS,將骨髓組織完整沖出至1.5 ml EP管中,1條股骨與1條脛骨骨髓置于同一個(gè)EP管中,冰上靜置5 min,吸去多余PBS。每管骨髓組織加入750 μl預熱的MSC消化酶,輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min,期間拿起顛倒數次。
2
骨內膜MSC取材:沖出骨髓后剩下的1條股骨與1條脛骨骨組織置于PBS + 2% FBS中,仔細剪碎骨組織,剪碎至骨髓腔*暴露,且碎片面積小于5 mm2 (圖2),將骨組織置于750 μl預熱的MSC消化酶中,輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min,期間拿起顛倒數次。
結果與分析
小鼠骨髓MSCs在Pdgfrα+和LepR+的細胞中富集,也有部分骨髓來(lái)源的MSC表達CD51,并且上述3個(gè)標記物有較高的共表達比例 (Morikawa等,2009; Zhou等,2014; Yue等,2016)。還有報道發(fā)現,Nestin-GFP (Mendez-Ferrer等,2010),Gli1-cre (Zhao等,2014; Schneider等,2017),Gremlin 1 (Worthley等,2015) 和N-cadherin (Zhao等,2019) 可富集骨髓MSCs,但這些分子標記物需要依賴(lài)熒光報告工具小鼠,故在此不介紹具體方法。在此,我們使用的小鼠骨髓和骨內膜間充質(zhì)干細胞的標志為CD45-Ter-119- CD31- LepR+或CD45- Ter-119-CD31- Pdgfrα+ 。圖3為同型對照的結果及劃門(mén)標準,圖4和圖5分別為骨髓和骨內膜間充質(zhì)干細胞分析流式圖和劃門(mén)方法。首先以FSC-A 和SSC-A 為軸,劃出主要細胞群,然后以FSC-A 和FSC-H去除黏連細胞,劃出單個(gè)細胞群,再根據7-AAD劃出活細胞群(7-AAD-)。接下來(lái)根據實(shí)驗需要劃出CD45- Ter-119- CD31- LepR+和CD45- Ter-119- CD31- Pdgfrα+細胞群,由流式結果可以得出,在骨髓和骨內膜MSC中LepR和Pdgfrα均有較高的共表達比例。
圖1. 小鼠股骨 (左)與脛骨 (右),虛線(xiàn)表示剪開(kāi)的地方
圖2. 骨內膜MSC取材示意圖
圖3. LepR 與Pdgfrα同型對照結果及劃門(mén)標準
圖4. 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分析流式圖
圖5. 小鼠骨內膜間充質(zhì)干細胞分析流式圖
失敗經(jīng)驗
骨髓組織未被消化:
無(wú)明顯MSC分群:
溶液配方
參考文獻
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:謝嘉怡, 王瑨, 趙萌. (2019). 小鼠骨髓與骨內膜間充質(zhì)干細胞分析. Bio-101: e1010338. DOI:10.21769/BioProtoc.1010338.
How to cite: Xie, J. Y. Wang,J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells. Bio-101: e1010338. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010338.
掃一掃 微信咨詢(xún)
© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有 備案號:粵ICP備19162636號
技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) 管理登陸 GoogleSitemap