細菌的流式檢測
Flow Cytometric Analysis of Bacteria  

摘要：傳統的細菌檢測 (如平板法和顯微技術(shù)) 耗時(shí)長(cháng)、誤差大、操作繁瑣并且無(wú)法提供細菌種屬和生物學(xué)狀態(tài)信息。近年來(lái)，隨著(zhù)熒光染料、結構光學(xué)和流式細胞檢測儀自身的不斷發(fā)展，利用流式細胞術(shù) (FCM) 檢測細菌等微生物成為可能。與傳統細菌檢測方法相比，FCM具有靈敏、快速、精確、高效的優(yōu)勢，同時(shí)結合其多參數數據采集特點(diǎn)，FCM可提供多種細菌的生物學(xué)信息，在實(shí)驗室研究、臨床診斷、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境監測等眾多領(lǐng)域具應用前景。本方案以污水中的大腸桿菌( E. coli )為例，介紹如何利用FCM分析零價(jià)鐵基微球 (A-mZVI) 對其滅活去污效果。

關(guān)鍵詞: 細菌, 大腸桿菌, 零價(jià)鐵基微球, 流式細胞儀

材料與試劑

1. 零價(jià)鐵基微球 (自制)
2. E. coli (Coli Genetic Stock Center)
3. 無(wú)水氯化亞鐵 (FeCl2，國藥集團，catalog number: XW77589431)
4.  乙二胺 (EDA，國藥集團，catalog number: 10009518)
5. 硼氫化na (NaBH4，國藥集團，catalog number: 80115816)
6. 氬氣 (武漢祥云化工有限公司)
7. 無(wú)水乙醇 (EtOH，國藥集團，catalog number: XW00641752)
8. 去離子水 (18.2 MΩ•cm，由Milli-Q Gradient System制取)
9. LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, L-13152)
10. 0.85% NaCl緩沖液
11. LB培養基
12. PBS溶液

    儀器設備

13.  高壓滅菌鍋 (Zealway)
14.  N52 NdFeB磁鐵 (K&J Magnetics)
15. 流式細胞儀 (BD, model: FACS AriaⅢ)
16. 恒溫振蕩器 (倍英，model: THZ-D)
17. 細菌培養箱
18. 比濁儀 (上海昕瑞，model: WGZ-2XJ)
19. 隔水式恒溫培養箱 (GNP-9160)
20.  離心機
21. 低溫冰箱

    軟件

22. FlowJo軟件

23. 實(shí)驗步驟

    一、 零價(jià)鐵基微球 (A-mZVI) 的制備

24. 氬氣氛圍下，將75 ml 0.9 M的EDA加入到300 ml的FeCl2水溶液中 (0.075 mol/L) 中，劇烈攪拌3分鐘。
25. 往上述溶液中加入75 ml 1.6 M的NaBH4水溶液，繼續攪拌25分鐘，直至溶液中不再有氣泡產(chǎn)生為止。
26. 離心收集黑色沉淀 (4,000 × g, 30 min), 先后用去離子水和無(wú)水乙醇反復洗滌三次，經(jīng)紅外燈干燥后獲得終產(chǎn)物 (A-mZVI)。

    二、 含E. coli污水的制備

27.  將 -70 °C冷凍干燥保存的E. coli菌株接種于高壓蒸汽處理過(guò)的LB培養基中，置于37 °C恒溫培養箱中繼續過(guò)夜。
28. 利用比濁儀 (OD600) 檢測細菌是否處于對數生長(cháng)期 (OD值為0.35~0.6之間)。
29. 將處于對數生長(cháng)期的細菌離心分離 (10,000 × g，10分鐘)，洗滌3次后重懸于0.85% NaCl的水溶液中。

30. 
    三、 流式細胞術(shù)分析A-mZVI對E. coli的滅菌效果

31.  取一定量的A-mZVI與50 ml含E. coli的菌液共孵育。
32. 在不同時(shí)間間隔，取5 ml上述混合液，通過(guò)N52 NdFeB磁鐵分離后取出上清液，用于后續流式分析其中E. coli的數量和存活狀態(tài)。
33. 樣本用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit進(jìn)行染色處理。按照廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)將試劑盒中組分A: SYTO 9 (3.34 mM) 和組分B: PI (20 mM) 按照1:1比例混合于適當體積的無(wú)菌PBS溶液中，搖勻，取0.8 ml上述混合液加到含E. coli的上清液中，在黑暗環(huán)境下室溫孵育15 min，無(wú)菌PBS洗滌3次后重懸于0.5 ml無(wú)菌PBS溶液中，完成實(shí)驗組樣本的制作。
34. 取未經(jīng)A-mZVI處理的菌體PBS懸液不進(jìn)行任何染色，作為雙陰性對照；未經(jīng)處理的細菌生物用SYTO 9單獨染色作為單陽(yáng)性對照，75%酒精處理30 min的細菌用PI單獨染色作為另一單陽(yáng)性對照。
35. FCM檢測：FCM檢測光源為氬燈 (激發(fā)光波長(cháng)488 nm)。設前向角 (FSC) 和側向角 (SSC) 的信號值為對數放大，FSC反映了細胞直徑的大小，SSC反映了細胞內顆粒的復雜程度。建立雙參數FSC/SSC散點(diǎn)圖和雙參數SYTO9-A/PI-A散點(diǎn)圖，根據其信號調節光電倍增管電壓，得到合適的FCM圖。重懸的菌液濃度為2 × 105~107個(gè)/ml，其中收集10,000個(gè)細菌作流式分析。在雙參數FSC/SSC散點(diǎn)圖中找到細菌集中的區域設門(mén)，圈出所需要分析的細菌。FITC通道檢測波長(cháng)530/30 nm，PE通道檢測波長(cháng)586/15 nm，FITC通道收集SYTO 9的綠色熒光，PE通道收集PI的紅色熒光，獲取FITC/PE散點(diǎn)圖，并用FlowJo軟件進(jìn)行數據分析。

    結果與分析

    零價(jià)鐵 (A-mZVI) 作為一種新型處理劑常用于水處理修復，其具有鐵低價(jià)無(wú)毒、來(lái)源廣泛、制備方法簡(jiǎn)便、反應速度較快的優(yōu)勢。對于微生物污染物而言，A-mZVI可發(fā)生芬頓反應，產(chǎn)生具有強氧化性的活性氧自由基 (ROS)，致使微生物發(fā)生氧化損傷，進(jìn)而實(shí)現高效滅活的目的 (Lv等，2017；Sun等，2019)。流式細胞術(shù) (FCM) 在污水細菌監測中具有測定精準、樣品前處理簡(jiǎn)單、可快速的對多參數數據進(jìn)行采集，以及可對多元數據進(jìn)行分析等優(yōu)點(diǎn)。因此，我們利用FCM分析模擬的污水中E. coli的數量和存活狀態(tài)，以此評價(jià)A-mZVI對E. coli的滅菌效果。如圖1所示，初始菌液 (圖1A，未經(jīng)A-mZVI處理組) 中，絕大部分細菌 (90%) 處于活菌狀態(tài)，加入A-mZVI處理后，細菌存活率急劇下降。其中，加入A-mZVI處理1小時(shí)后，E. coli存活率下降至32.6% (圖1B)；2小時(shí)后，E. coli存活率下降至19.5% (圖1C)。結果表明，A-mZVI具有優(yōu)異的抗菌效果，且呈時(shí)間依賴(lài)性。

36. 

37. 圖1. E. coli經(jīng)LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit染色后的流式細胞分析結果. A.空白組； B. A-mZVI處理1小時(shí)； C. A-mZVI處理2小時(shí)。細胞被分為四個(gè)子集：左下、右下、左上和右上象限依次代表陰性背景、活細菌、死細菌和損傷細菌。

    失敗經(jīng)驗

38. 因細菌比較小，在流式檢測時(shí)為減少雜信號的影響，通常會(huì )加入FSC-H和FSC-A的散點(diǎn)圖去除黏連。
39. 細菌濃度需要控制。實(shí)驗中，我們發(fā)現制備1 × 107個(gè)/ml濃度的細菌進(jìn)行染色后，測出的流式結果比較好。
40. 除了大腸桿菌，其他菌種 (如：乳酸菌、趨磁細菌、化膿性鏈球菌、球芽孢桿菌、草生歐文氏菌等) 也可利用流式細胞術(shù)，分析細菌濃度、細菌活力、種屬、群體分化等相關(guān)指標。

    致謝

    本文實(shí)驗方案改編自 (Sun等，2019)，所述零價(jià)鐵基微球和含菌污水由華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供，相關(guān)流式細胞檢測方法由中科院武漢病毒所分析測試中心建立并完成。

    參考文獻

41. Lv, Y., Niu, Z., Chen, Y. and Hu, Y. (2017). Bacterial effects and interfacial inactivation mechanism of nZVI/Pd on Pseudomonas putida strain. Water Res 115: 297-308.
42. Sun, H., Wang, J., Jiang, Y., Shen, W., Jia, F., Wang, S., Liao, X. and Zhang, L. (2019). Rapid aerobic inactivation and facile removal of Escherichia coli with amorphous zero-valent iron microspheres: indispensable roles of reactive oxygen species and iron corrosion products. Environ Sci Technol 53(7): 3707-3717.

    Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

    引用格式：閔娟, 關(guān)武祥. (2019). 細菌的流式檢測. Bio-101: e1010317. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010317.
    How to cite: Min, J. and Guan, W. X.  (2019). Flow Cytometric Analysis of Bacteria. Bio-101: e1010317. DOI:10.21769/BioProtoc.1010317.